一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种利用组织培养技术进行多花黄精种苗快速繁殖的方法。其特征在于包含了外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化及不定芽形成、不定芽根的诱导培养、炼苗和移栽等步骤的多花黄精组织培养快速繁殖体系。其显著特征是，以多花黄精顶芽作外植体，用70～75％的酒精和5～18％的NaClO组合消毒，快繁体系污染率可控制在5％以下。依据该快繁体系，6个月内，繁殖系数达80倍左右，即一个顶芽平均可产生80多棵组培苗。后期因可省却愈伤组织诱导过程，愈伤组织能持续分化，从而更利于组培苗的生产。本方法是一种高效、快捷、环境友好的繁殖技术体系，短期内可实现多花黄精良种的规模化生产。

A Rapid Propagation Method of Polygonatum multiflorum L. with Top Bud as Explant

The invention discloses a method for rapid propagation of Polygonatum multiflorum seedlings by tissue culture technology. Its characteristics include explant selection, disinfection and other treatments, callus induction, callus proliferation, callus differentiation and adventitious bud formation, adventitious bud root induction and culture, seedling refining and transplantation and other steps of Polygonatum tissue culture and rapid propagation system. The remarkable characteristic is that the polluting rate of rapid propagation system can be controlled below 5% by using the terminal bud of Polygonatum multiflorum as explant and disinfecting with 70-75% alcohol and 5-18% NaClO. According to the rapid propagation system, within six months, the propagation coefficient was about 80 times, that is to say, more than 80 tissue-cultured seedlings could be produced by one apical bud on average. Because the induction process of callus can be omitted in the later stage, the callus can differentiate continuously, which is more conducive to the production of tissue culture seedlings. This method is an efficient, fast and environmentally friendly reproduction technology system, which can realize the large-scale production of fine varieties of Polygonatum multiflorum in a short time.

【技术实现步骤摘要】
一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法
本专利技术涉及药用植物的组织培养技术，尤其涉及多花黄精的组织培养技术，包括外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化、不定芽形成、不定芽的生根培养、炼苗和移栽等步骤。
技术介绍
黄精是我国传统中药材，为百合科黄精属多年生草本植物。多花黄精是《中华人民共和国药典》2015年版收藏的黄精属3种原生药之一，又称姜形黄精。其性味甘平，补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干少食，肺虚燥咳，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等症。多花黄精的繁殖主要有块茎繁殖和种子繁殖两种。生产上，块茎繁殖主要靠采挖野生块茎为种源进行无性繁殖，繁殖系数低，用量巨大，对自然野生资源构成巨大破坏；同时，连续多代的块茎繁殖，常造成植株内病毒富积而退化，个体生长势逐渐变弱，产量越来越低。种子繁殖时，因种子休眠期长、不易萌发、发芽率低等原因，生长速度不如块茎繁殖方法。组织培养是一种十分有效的快速繁殖手段。应用该方法，可在短期内得到大量的种苗。迄今，已有多人对多花黄精的组织培养方法进行了研究[1～5]，研究者多选用地下块茎和块茎之芽点为研究材料，此材料因不可避免地附带大量细菌和真菌，消毒十分困难。因此，上述研究工作无一例外地依赖高效灭菌剂—HgCl2消毒。但HgCl2的重金属残留往往会对植物造成伤害，废液的不当处理也会对环境造成危害。因此，这些方法均不适于规模化生产时采用。同时，上述研究结果表明，用上述组织培养方法获得的多花黄精的繁殖系数只有10左右，效率比较低下，意味着使用这些方法进行规模化生产时，成本会居高难下。
技术实现思路
解决的技术问题：针对现有组培技术存在的不足，本专利技术提供了一种简便、高效、免HgCl2消毒的多花黄精外植体消毒方法，同时提供了一整套多花黄精的组织培养技术。技术方案：一种以顶芽为外植体的多花黄精种苗快速繁殖方法，其特征在于包括以下7个步骤：(1)外植体的选择；(2)外植体的消毒；(3)外植体的处理；(4)愈伤组织的诱导；(5)愈伤组织的增殖和分化；(6)生根培养；(7)炼苗移栽。上述步骤(1)方法如下：选择多花黄精的顶芽为外植体，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖。用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽。此顶芽可进行后续处理；上述步骤(2)方法如下：将步骤1所得顶芽进行表面消毒，具体方法是：用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，优选15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，优选9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用；上述步骤(3)方法如下：将步骤(2)中所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用灭菌手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，但不限于两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织或多份顶芽组织作为外植体备用；上述步骤(4)方法如下：在超净工作台内，无菌条件下，将按步骤(3)所示方法处理后的外植体，切面向下平铺于诱导培养基中，培养基组分为1/2MS培养基，另外添加2～7mg/L的6-BA、0.1～0.4mg/L的NAA、0.2～0.8mg/L的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8。培养温度为(23±1)℃，湿度为60％。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养。8～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm左右。将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面。培养20～34d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生；上述步骤(5)方法如下：将按步骤(4)所示方法操作所得之愈伤组织继续培养40～60d。待其细胞分裂增殖至体积约1cm3时，在无菌超净工作台内将其切下，切成大小约为0.5cm3的小块，将切好的愈伤组织再平铺于步骤(4)中所述之培养基中，并在步骤(4)中设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽；上述步骤(6)方法如下：将按步骤(5)所示方法操作后所得到的不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎状组织。将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养。该生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.8mg/L(优选浓度0.2～0.5mg/L)的NAA，浓度2～5g/L(优选浓度2～3.5g/L)的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤(4)中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等培养条件培养。培养15～24d后，不定芽开始陆续长根。待根长出2条以上，平均长度1～3cm时，即可进行炼苗。上述步骤(7)方法如下：将按步骤(6)所示方法操作所得之装有生根组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后组培容器瓶盖打开一半培养12～24h；从所述组培容器中取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照(8～12)：(4～6)：(2～6)：(1～3)的体积比(优选(8～10)：(4～5)：(3.5～5)：(1～2))的体积比，混合后在约100℃高温下常压灭菌15～26h。移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％左右、每天通风3～5次的条件下培养。待单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田或林下培养即可。有益效果：本专利技术以多花黄精春季萌发的地上顶芽为外植体，获得了多花黄精从取得外植体到组培苗温室大棚下培养出可用于大田栽培容器苗的全套技术方法。该技术方法具有以下优点：(1)省时、省力：外植体取自多花黄精地上部分，不需要采挖地下块茎。同时地上部分较干净，去污、净化手续简单便捷。(2)简便、高效、无HgCl2残留：外植体只需用70～75％的酒精和5～18％的NaClO进行分步消毒，最后用灭菌水稍加漂洗即可完成。不用HgCl2消毒，因此无HgCl2残留，也无需用大量的灭菌水来漂洗，节约了水资源，减少了对环境的潜在危害。该方法消毒效果好，可将外植体污染率控制在5％以内。(3)保护多花黄精野生资源：外植体取自春季萌发多花黄精的顶芽。顶芽采收后，地下块茎可继续萌发新芽，不破坏多花黄精地下块茎营养的积累。(4)繁殖系数高：使用本专利技术的成套技术方法，繁殖系数可达80倍，是现有公开结果中最高繁殖系数的8倍[4,5]。技术优势明显。(5)技术体系完整：提供了多花黄精组培过程中从外植体采集到组培苗温室大棚炼苗的成套技术方法，并对各个技术环节进行了充分优化，适于多花黄精种苗的规模化生产。附图说明图1：多花黄精地上未展叶顶芽图2：多花黄精顶芽纵切后平铺于愈伤组织诱导培养基中图3：多花黄精叶与茎交接处长出愈伤组织图4：多花黄精叶与茎交接处长出的愈本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法，其特征在于外植体为经过非HgCl2消毒的幼嫩顶芽，外植体经过愈伤组织诱导、增殖和分化，及生根诱导、练苗、移栽培养等程序成为健康且可生产利用的植株。

【技术特征摘要】
1.一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法，其特征在于外植体为经过非HgCl2消毒的幼嫩顶芽，外植体经过愈伤组织诱导、增殖和分化，及生根诱导、练苗、移栽培养等程序成为健康且可生产利用的植株。2.权利要求1所称顶芽，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽，此顶芽可进行后续处理。3.权利要求2所称顶芽的后续处理，是指将上述顶芽进行表面消毒，具体方法是：用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，优选15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，优选9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用。4.权利要求2所述顶芽后续处理，是将按权利要求3所述处理方法处理后的顶芽，用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，但不限于两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织或多份顶芽组织作为外植体备用。5.权利要求1所述愈伤组织的诱导，是指无菌条件下，将按权利要求4的步骤处理后的外植体，切面向下平铺于诱导培养基中，培养基组分为1/2MS培养基，另外添加2～7mg/L的6-BA、0.1～0.4mg/L的NAA、0.2～0.8mg/L的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8，培养温度为(23±1)℃，湿度为60％；初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养，8～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶，将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm左右，将茎段埋进诱导培养基中而叶片露...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈宝明，谭著明，杨硕知，申爱荣，谭云，
申请(专利权)人：湖南省林业科学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43