多肽、其生产方法和用途技术

技术编号:20261602 阅读:40 留言:0更新日期:2019-02-02 00:01
本发明专利技术涉及多肽、其生产方法和用途。所述多肽包含N端区域和C端区域。本发明专利技术的多肽具有显著的细胞黏附效果。

Peptides, their production methods and Applications

The present invention relates to polypeptide, its production method and use. The polypeptide comprises N-terminal region and C-terminal region. The polypeptide of the invention has remarkable cell adhesion effect.

【技术实现步骤摘要】
多肽、其生产方法和用途
本专利技术属于基因工程
,涉及多肽、其生产方法和用途。
技术介绍
:胶原蛋白一般为白色、透明、无分支的原纤维,是皮肤和骨骼的基础支撑物,可以占到蛋白质总量的25%~35%,主要分布于人体的皮肤、血管、骨骼、筋腱、牙齿和软骨等处,是这些组织的主要基质和支架,保护并连结各种组织,在体内发挥着重要的生理功能。因此,胶原蛋白可以广泛的应用在医药和化妆品等行业中。当前市场上销售的胶原蛋白产品都是取自猪、牛、鱼等动物组织中。以胶原蛋白的氨基酸组成而言:哺乳动物猪、牛与人的相似度为95%,鱼与人的相似度65%。虽然哺乳动物猪、牛等与人的胶原蛋白相似度较高,其仍然难以避免病毒感染以及致敏性的危险。而食用鱼类所萃取的胶原蛋白人体的利用率低于65%,无法完全被人体吸收与利用。所以其常用于食品运用,少部分运用于化妆品,但无法被用于医疗器材或较精密的组织工程产品。所以,目前的胶原蛋白只能在化妆品和保健品中使用,根本无法发挥胶原蛋白的原本生物学功能。从结构上来说,人体天然的胶原蛋白的结构非常的复杂,所以才导致人源胶原蛋白极难通过常规手段表达和大量制备。胶原蛋白最普遍的结构特征是由3条肽链形成的三螺旋结构,即由3条A肽链以右手超螺旋方式形成蛋白质,这样的三股螺旋区域被称为胶原区域。每个A肽链在分子结构上都是由重复出现的Gly-X-Y(X、Y代表Gly之外的任何氨基酸残基,X往往是Pro,Y往往是Hyp)肽段构成左手螺旋,3条链在氨基酸残基的相互作用下,以同一轴为中心,以右手超螺旋方式形成稳定的三股螺旋结构。在生物体中,胶原蛋白的合成和修饰从原胶原开始,经历了羟基化、糖基化、相互交联等诸多化学变化,受到了多种生物酶的复杂调控。原胶原除了含有胶原链之外,还含有球状的头部和尾部。没有这些头部和尾部,胶原链就不会折叠成为正确的三螺旋,从而缺乏胶原蛋白的生物学活性。因此,按照原始基因序列制备的胶原蛋白不可能在体外自发的组织形成正确的空间结构。这样的困难严重阻碍了人胶原蛋白的研发和生产。生产胶原蛋白的传统方法是利用酸、碱、酶解法处理动物来源的组织,提取胶原蛋白衍生物。这些方法提取的胶原蛋白本身已经丧失了原本的生物学活性,无法应用于生物医学领域发挥真正的功能。大多数经过制备后的胶原蛋白产品,拉伸强度较弱;纯胶原蛋白在体内降解较快,以及可能存在潜在的抗原性等,同时由于胶原蛋白的来源、加工工艺和原料配比的差异,产品的营养成分及饲用价值也不相同,且皮料在加工过程中不仅要接触许多化学物质,且易受到细菌的感染,严重限制了胶原蛋白的应用。虽然国外研究机构通过培育含人胶原蛋白基因的小鼠,得到了含有人胶原蛋白的乳汁,但是这样生产的成本过高,生产周期过长,无法投入大规模生产。
技术实现思路
针对上述现有技术的缺陷,本专利技术提供了:1.多肽,所述多肽包含SEQIDNo.1(人I型胶原蛋白COL1A1的全长序列)中的至少60个连续的氨基酸残基的N端区域和包含以SEQIDNo.2所示的序列GAPGPCCGG的C端区域,其中优选地,所述多肽是胶原蛋白多肽,优选是人源胶原蛋白多肽;其中优选地,所述N端区域为重复n次的基本重复单元,n为大于等于1的整数,优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10,优选地n为4;其中优选地,所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基。2.根据1所述的多肽,其中所述N端区域包含选自SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的序列。3.1或2所述的多肽,其包含a)SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列b)与SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列具有90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,其保留SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列的细胞黏附效果;c)SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,优选为保守氨基酸取代,所述氨基酸序列保留SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列的细胞黏附效果;或d)由核苷酸序列编码的氨基酸序列,所述核苷酸序列与编码SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列的多核苷酸序列在严格条件下杂交,其保留SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列的细胞黏附效果,所述严格条件是中等严格条件,中-高严格条件,高严格条件或非常高严格条件。4.多核苷酸,其编码根据1-3中任一项所述的多肽。5.表达载体,其包含根据4所述的多核苷酸。6.宿主细胞,其包含根据5所述的表达载体,其中所述宿主细胞优选是大肠杆菌。7.根据权利要求1所述的多肽的生产方法,其包括:(1)在生产培养基中培养根据6所述的宿主细胞并生产多肽;(2)收获并纯化多肽;和(3)任选地对多肽进行酶切。8.组合物,优选医疗器材、组织工程产品、化妆品或保健品,其包含根据1所述的多肽。9.根据1所述的多肽在制备组合物,优选医疗器材、组织工程产品、化妆品、保健品中的用途。10.根据1所述的多肽促进细胞黏附的用途。与现有技术相比,本专利技术具有以下特点:(1)本专利技术首次选择的I型胶原蛋白序列为长期筛选优化的序列;相比于I型胶原蛋白的其它片段具有显著更好的细胞黏附效果。本专利技术的重组I型胶原蛋白片段以较短的序列长度便更好地实现了I型胶原蛋白片段的细胞黏附活性。(2)采用大肠杆菌表达系统,适于大规模放大,20小时即可完成一轮发酵,生产成本非常低,由于对基因序列进行了大肠杆菌的密码子优化以及选用2×YT培养基,使得产量非常大;(3)生产的重组人源胶原蛋白具有非常好的亲水性和稳定性,其氨基酸组成与天然胶原蛋白氨基酸序列相应部分100%相同,应用于人体不会产生免疫排斥和过敏反应,可以广泛应用于生物医药和化妆品行业;(4)本专利技术产品经过活性检测,具有达到甚至超过人体天然蛋白的生物学活性,是目前报道过的最优化的胶原蛋白设计方案,可以在人体中行使天然蛋白的功能,达到真正的产品应用的目的。附图说明图1为用于本专利技术载体pET32a-C1S4T(SEQIDNO.5)、pET32a-C1S5T(SEQIDNO.6)构建的质粒pET32a的图谱;图2为本专利技术C1S4T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图;C1S4T蛋白的电泳检测分子量约为36kDa,对应于包含SEQIDNO.5的氨基酸序列的蛋白质。图3为本专利技术C1S5T蛋白纯化酶切后得到的目的蛋白电泳图;C1S5T蛋白的电泳检测分子量约为36kDa,对应于包含SEQIDNO.6的氨基酸序列的蛋白质。图4为本专利技术C1S4T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。图5为本专利技术C1S5T蛋白与人胶原蛋白相比较的生物活性检测结果。具体实施方式下文提供进一步的描述以便于理解本专利技术。如本文中使用,“医疗器械”是指直接或者间接用于人体的仪器、设备、器具、体外诊断试剂及校准物、材料以及其他类似或者相关的物品。如本文中使用,“组织工程产品”是指用于组织工程的产品。组织工程是一门以细胞生物学和材料科学相结合,进行体外或体内构建组织或器官的新兴学科。在本专利技术中,选择II型胶原蛋白序列为筛选优化的序列。所述人胶原I型COL1A1的序列是NCBI参照序列:NP_000079(SEQIDNo本文档来自技高网
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【技术保护点】
1.多肽,所述多肽包含N端区域和C端区域,其中所述N端区域包含SEQ ID No.1中的至少60个连续的氨基酸残基的N端序列;其中所述C端区域包含以SEQ ID No.2所示的序列GAPGPCCGG;其中优选地,所述多肽是胶原蛋白多肽,优选是人源胶原蛋白多肽;其中优选地,所述N端区域包含N端序列的n个重复,n为大于等于1的整数,优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;其中优选地,所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基。

【技术特征摘要】
1.多肽,所述多肽包含N端区域和C端区域,其中所述N端区域包含SEQIDNo.1中的至少60个连续的氨基酸残基的N端序列;其中所述C端区域包含以SEQIDNo.2所示的序列GAPGPCCGG;其中优选地,所述多肽是胶原蛋白多肽,优选是人源胶原蛋白多肽;其中优选地,所述N端区域包含N端序列的n个重复,n为大于等于1的整数,优选地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10;其中优选地,所述N端区域与C端区域是连续的或者间隔1个或多个氨基酸残基。2.根据权利要求1所述的多肽,其中所述N端区域包含选自SEQIDNo.3和SEQIDNo.4的序列。3.根据权利要求1或2所述的多肽,其包含a)SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列;b)与SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列具有90%、92%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,其保留SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列的细胞黏附效果;c)SEQIDNo.5或SEQIDNo.6的氨基酸序列中添加、取代、缺失或插入1个或多个氨基酸残基的氨基酸序列,其保留...

【专利技术属性】
技术研发人员:杨霞
申请(专利权)人:山西锦波生物医药股份有限公司
类型:发明
国别省市:山西,14

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