重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1及制备方法技术

本发明专利技术公开一种重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK‑M1及其制备方法，本发明专利技术从改造重组布氏白僵菌的蛋白酶K分子结构入手，得到活性和稳定性均提高的蛋白酶K突变体PK‑M1，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；优化表达系统，利用酵母细胞外分泌表达技术，可大规模发酵高效表达重组蛋白酶K突变体，进一步提高蛋白酶K产量；采用高效亲和层析的蛋白纯化方式，提高蛋白酶K纯化过程中的收率，实现了蛋白酶K的规模化生产。

Recombinant Beauveria bassiana protease K mutant PK-M1 and its preparation method

The invention discloses a recombinant Beauveria bassiana protease K mutant PK_M1 and its preparation method. The method starts with the modification of the molecular structure of the recombinant Beauveria bassiana protease K, and obtains a protein K mutant PK_M1 with improved activity and stability. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO:1; The expression system is optimized and the large-scale development can be achieved by using yeast exocrine expression technology. Recombinant protease K mutant was efficiently expressed by fermentation to further increase the production of protease K. The yield of protease K was increased by high efficiency affinity chromatography, and the large-scale production of protease K was realized.

【技术实现步骤摘要】
重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1及制备方法
本专利技术涉及基因改造和蛋白质工程
，具体涉及一种酶活力高、稳定性好、操作简便、适用于大规模生产的重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1及制备方法。
技术介绍
蛋白酶K（ProteinaseK,EC3.4.21.64）是一种重要的丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌（Tritirachiumalbumlimber）的提取物中发现。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键。蛋白酶K在生化实验中应用较为广泛：在核酸提取中，可以除去核酸中的DNA酶和RNA酶；在原位杂交中，具有降解包围靶DNA蛋白质的作用，可用来处理杂交前的样本，提高检测的灵敏性；在生物检测方面，可以用来检测脑组织中的致病性朊病毒。除此之外，蛋白酶K在污水处理、工业制造、造纸、生物加工过程及饲料等领域展现出良好的应用效果。目前，生产蛋白酶K主要有两条途径：一是由林伯氏白色念球菌经发酵后分离纯化本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK‑M1，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种权利要求1所述重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体PK-M1的制备方法，其特征在于按照如下步骤进行：a.构建重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体pPIC9K-M1合成如SEQIDNO.2所示的M1编码序列并克隆至pUC57质粒中，得到pUC57/M1质粒；扩增pUC57/M1质粒，分别用限制性内切酶EcoRI、NotI将M1编码序列切下，与进行同样双酶切的pPIC9K载体连接，将连接产物转化至TOP10感受态细胞，挑取克隆，扩增质粒，得到重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体载体pPIC9K-M1；b.将重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体表达载体pPIC9K-M1转化到GS115酵母感受态细胞利用限制性内切酶SalI酶切重组布氏白僵菌蛋白酶K突变体载体pPIC9K-M1，再用TE缓冲液溶解至浓度为2μg/μL的线性片段，取10μL线性片段与GS115酵母感受态细胞混匀，转移至冰预冷的电转杯中，冰浴5min后电击；之后向电转杯中加入1mL冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀后转至1.5mLEP管中，30℃静置孵育5h；将菌体悬液每200μL涂布一块MD平板上，将MD平板置于30℃环境培养至出现单个菌落；c.筛选高拷贝数和Mut+表型的GS115/pPIC9K-M1酵母单菌落配制浓度5g/LG418的YPD筛选平板，在MD平板上挑取200个长出的菌落，点在所述浓度5g/LG418的YPD筛选平板中，再筛选出直径大于2mm的酵母菌落，并以所筛选出...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳敏，李民强，
申请(专利权)人：大连博格林生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：辽宁,21