一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法技术

本发明专利技术公开了一种促进间充质干细胞分化成神经元的方法，包括以下步骤：1)制备人间充质干细胞并传代培养；2)使传代培养后的所述人间充质干细胞在分化培养基中分化成人间充质干细胞‑神经球；3)使所述人间充质干细胞‑神经球在诱导培养基中分化成神经元。通过诱导培养基中添加神经营养因子来促进向神经元的分化，结果表明表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β‑微管蛋白III)的细胞相对于空白对照有显著提高。本发明专利技术的方法为促进脊髓损伤修复的新治疗方法提供了一定的方向。

【技术实现步骤摘要】
一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法
本专利技术涉及细胞培养
，尤其涉及一种促进间充质干细胞分化为神经元的方法。
技术介绍
脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是一种严重的中枢系统疾患，其最严重的后果，是导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，其造成的截瘫会使患者失去自理能力，这不仅给患者带来了严重的身体和心理伤害，也给家庭造成沉重的负担。目前在脊髓损伤病人的治疗中，通常借助于一些药物的使用以及与物理治疗相结合来减缓瘫痪的程度。但是，经过这样的治疗，患者的生活质量还是无法得到很好的提升。如何使得脊髓损伤后中枢神经的修复和功能重建，现在仍然是一个难题。虽然神经生长因子的发现给中枢神经损伤的临床药物治疗带来了希望，也达到了一定的效果，但是，神经营养物质分子量太大，无法穿透血脑屏障进入中枢神经组织以发挥其活性。在脊髓损伤中，移植可能是进行中枢神经系统修复的一种可操作方法。但是，要实现细胞的移植治疗，首先需要对细胞分化成神经元的能力进行研究和评估，并开发促进细胞分化的方法。因此，本领域的技术人员致力于开发一种促进干细胞分化成神经元的方法。
技术实现思路
为实现上述目的，本专利技术提供了一种促进间充质干细胞分化成神经元的方法。在本专利技术的一个较佳实施方式中，该方法，包括以下步骤：1)制备人间充质干细胞并传代培养；2)使传代培养后的所述人间充质干细胞在分化培养基中分化成人间充质干细胞-神经球；3)使所述人间充质干细胞-神经球在诱导培养基中分化成神经元。优选地，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的含有所述诱导培养基的培养容器中，于37℃，5％CO2培养分化7-10天。进一步地，诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及10ng/mL重组人BDNF的NB培养基。在另一个优选的实施方式中，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的培养容器中，先使用含有BDNF的第一诱导培养基进行诱导分化5-6天，然后使用含有TGF-β1的第二诱导培养基进行诱导分化4-5天，细胞于37℃，5％CO2培养。进一步地，再添加含有TGF-β1的第二诱导培养基后，先将细胞在40℃，5％CO2中培养3-4小时，然后再转移到37℃，5％CO2继续培养分化4-5天。进一步地，第一诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及10ng/mL重组人BDNF的NB培养基；第二诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及1-5ng/LTGF-β1的NB培养基。进一步地，步骤1)具体为对脐带进行酒精消毒，于平衡盐溶液中清除血管，将华通氏胶中的间充质组织切割成0.4-0.6cm3大小，离心获取间充质组织部分，使用无血清DMEM/F12培养基洗涤；洗涤离心后获得的沉淀部分进行酶消化；对酶消化后的悬浮液进行细胞计数，然后进行接种培养，即获得人间充质干细胞；当细胞生长至70％-80％融合率时进行传代。优选地，步骤2)采用步骤1)第四代至第六代的人间充质干细胞进行。进一步地，步骤2)包括：酶法分离步骤1)中培养的人间充质干细胞，并接入含有分化培养基的组织培养低粘附性塑料烧瓶中进行培养；其中，分化培养基为含有20ng/ml表皮生长因子、20ng/mL碱性成细胞生长因子和1:50稀释的B27的NB培养基；细胞在37℃，5％CO2下培养，每3-4天添加新鲜的表皮生长因、碱性成细胞生长因子和B27，一周更换一次分化培养基。本专利技术的另一个方面还提供了一种利用上述促进间充质干细胞分化成神经元的方法在研究脊髓损伤后的神经修复中的应用。使用本专利技术中的方法，能有效提高间充质干细胞分化为神经元的比例。使用含有BDNF的诱导培养基进行诱导分化后的细胞中，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例与空白对照组相比，有了显著的提高，能分别达到8±1.9％和38.6±2.9％。而使用含有BDNF的第一诱导培养基和含有TGF-β1的第二诱导培养基进行诱导分化后的细胞中，表达成熟神经标记物(MAP2ab)和不成熟神经标记物(β-微管蛋白III)的细胞比例与空白对照组相比，也显著提高，并且，相对于只使用含有BDNF的诱导培养基进行诱导分化后，两种阳性细胞比例也有进一步提高。本专利技术的方法为促进脊髓损伤修复的新治疗方法提供了一定的方向。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。附图说明图1是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞的初代培养中，出现两种细胞形态，图1a是长条形的，图1b是圆形的。图2是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞第三代传代细胞培养至80％融合率时的细胞形态；图3是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞重新接种到神经球分化培养基1-2天后的细胞开始聚集的形态。图4是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞在转化后的3-4天出现许多漂浮细胞的球体。图5是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞的第3代的CD44染色结果。图6是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞衍生而来的神经球的nesting阳性标记图。图7是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成β-微管蛋白III(不成熟神经标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。图8是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成GFAP(星形胶质细胞标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。图9是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成CalC(少突胶质细胞标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。图10是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成MAP2ab(成熟神经标记物)阳性细胞的免疫荧光组织化学法结果图。图11是本专利技术的一个较佳实施例的人间充质干细胞分化成不同神经标记物阳性细胞的相关蛋白水平的蛋白质印记法检测结果图。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本专利技术的多个优选实施例，使其
技术实现思路
更加清楚和便于理解。本专利技术可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本专利技术的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。本专利技术具体实施方式中使用的实验方法，若无特殊说明，均为本领域常规的方法。本专利技术具体实施方式中使用的试剂，若无特殊说明，均可通过购买获得。人间充质干细胞同时具有胚胎干细胞和成体干细胞的许多优势，并且相对于其他的干细胞，其优势在于：可塑性强；容易通过低侵袭性的方式获得，并且能够快速增殖；免疫兼容，患者自己的人间充质干细胞能用于自体移植。因此，本专利技术使用人间充质干细胞为起始物进行分化研究。在神经发生中，微环境因子对增殖和分化有十分重要的影响。其中，BDNF广泛地分布在发育和成熟的神经系统中，并在神经细胞的发育、存活和修复中起到十分重要的作用。本研究通过不同的营养因子与不同的条件的结合，观察人间充质干细胞分化成神经元的效果。实施例1人间充质干细胞的制备获取新生儿脐带，放置于汉克斯平衡盐溶液(HBSS，Gi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备人间充质干细胞并传代培养；2)使传代培养后的所述人间充质干细胞在分化培养基中分化成人间充质干细胞‑神经球；3)使所述人间充质干细胞‑神经球在诱导培养基中分化成神经元。

【技术特征摘要】
1.一种促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备人间充质干细胞并传代培养；2)使传代培养后的所述人间充质干细胞在分化培养基中分化成人间充质干细胞-神经球；3)使所述人间充质干细胞-神经球在诱导培养基中分化成神经元。2.如权利要求1所述的促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的含有所述诱导培养基的培养容器中，于37℃，5％CO2培养分化7-10天。3.如权利要求2所述的促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，所述诱导培养基为添加有0.5umol/L全反式维甲酸、1％FBS、5％马血清、1％N2补充物、1％青霉素/链霉素以及10ng/mL重组人BDNF的NB培养基。4.如权利要求1所述的促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，步骤3)具体为将步骤2)中的人间充质干细胞-神经球打碎，接种到多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白双包被的培养容器中，先使用含有BDNF的第一诱导培养基进行诱导分化5-6天，然后使用含有TGF-β1的第二诱导培养基进行诱导分化4-5天，细胞于37℃，5％CO2培养。5.如权利要求4所述的促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，在添加含有TGF-β1的第二诱导培养基后，先将细胞在40℃，5％CO2中培养3-4小时，然后再转移到37℃，5％CO2继续培养分化4-5天。6.如权利要求5所述的促进间充质干细胞分化成神经元的方法，其特征在于，所述第一诱导培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈金虎，
申请(专利权)人：宁波金未生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33