一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种将非神经元细胞转分化为神经元细胞的方法，其包括对非神经元细胞的胞外基质‑骨架系统进行干扰处理，其中干扰处理选自：采用细胞骨架蛋白小分子抑制剂进行处理，采用小干扰RNA(siRNA)对胞外基质‑骨架系统的特定基因表达进行敲低处理，对胞外基质进行低粘附处理并定向分化培养。本发明专利技术的方法应用简单，只需单个小分子或单因素处理，并且在体内体外均可高效进行，在组织再生、修复和肿瘤治疗中具有重大应用。

【技术实现步骤摘要】
一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及通过对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理从而将人和动物的非神经元细胞转化为功能性神经元的方法。
技术介绍
调控细胞命运，从而产生具有不同功能的特定细胞类型，在细胞替代治疗和再生治疗中具有重要应用前景。细胞命运取决于基因组的特异性表达，而表达调控方式既包括常见的生物学调控，如信号转导、转录调控网络、表观遗传修饰等，也受细胞的理化特性以及细胞所处环境中的理化因素的调控。因此细胞命运转变的方法也分为两种，即改变细胞的生物学特性和理化特性。目前通过调控细胞命运产生功能细胞的方法主要是针对若干重要基因调控通路和表观遗传修饰，通过遗传学手段或者化学小分子处理手段来完成。遗传学手段包括研究人员利用异位表达Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等转录因子将小鼠和人的成纤维体细胞重编程为诱导多能性干细胞；利用异位表达Adcl1、Brn2和Myt1l等转录因子将成纤维细胞转分化为功能性神经元；以及利用异位表达特定基因的方式获得具有功能的心肌细胞、胰岛细胞等。化学小分子手段包括研究人员利用化学小分子组合VC6TFZ将小鼠成纤维细胞重编程为多能性干细胞；利用7种小分子组成的组合(VCRFSGY)将人的成纤维细胞直接转化为神经元；利用9种小分子的组合M9将小鼠成纤维细胞重编程为神经干细胞，进而分化为功能性神经元；利用小分子组合将人胃上皮细胞转变成多潜能的内胚层祖细胞；利用小分子组合将将人的成纤维通过小分子转化为心肌细胞等。
技术实现思路
本专利技术主要通过对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理，从而实现对细胞命运进行调控，特别地，在将人或动物的非神经元细胞转分化为神经元细胞的方面提出了更为简便易行的途径，取得了开创性的、预料不到的技术效果。本专利技术提供了一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的方法，其特征在于所述方法包括对非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理。本专利技术的干扰处理选自以下的至少一种：采用细胞骨架蛋白抑制剂进行处理，采用小干扰RNA(siRNA)对胞外基质-骨架系统的基因表达进行敲低处理，对胞外基质进行低粘附处理并优选进一步定向培养。根据本专利技术的一个实施方式，其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种：肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂。优选地，其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种：(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7，浓度为10μM以上，优选20μM以上，更优选10-30μM，其中所述浓度为所述抑制剂在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的最终浓度。优选地，其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种：CytochalasinB、LatrunculinB，其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上，优选2μM以上，更优选2-3μM，LatrunculinB浓度为0.15μM以上，优选0.2μM，更优选0.2-0.3μM，其中所述浓度为所述抑制剂在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的最终浓度。根据本专利技术的一个实施方式，所述方法包括将非神经元细胞置于诱导培养基中培养3-7天，任选地4天、5天或6天，然后采用成熟培养基培养7-14天，任选地8天、9天、10天、11天、12天或13天。优选地，其中所述诱导培养基包含：细胞骨架蛋白抑制剂、N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇。优选地，其中所述成熟培养基包含：N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇，神经营养素(NT3)，脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。根据本专利技术的一个实施方式，本专利技术中非神经元细胞优选为成纤维细胞和/或神经胶质细胞。本专利技术还提供了细胞骨架蛋白抑制剂用于将非神经元细胞转分化为神经元细胞的用途。本专利技术还提供了一种将非神经元细胞转化为神经元细胞的试剂盒，所述试剂盒包括诱导培养基，所述诱导培养基包含细胞骨架蛋白抑制剂。根据本专利技术的一个实施方式，其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种：肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂。优选地，其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种：(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7，浓度为10μM以上，优选20μM以上，更优选10-30μM，其中所述浓度为所述抑制剂在诱导培养基中的浓度。优选地，其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种：CytochalasinB、LatrunculinB，其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上，优选2μM以上，更优选2-3μM，LatrunculinB浓度为0.15μM以上，优选0.2μM，更优选0.2-0.3μM，其中所述浓度为所述抑制剂在诱导培养基中的浓度。根据本专利技术的一个实施方式，所述试剂盒还包括成熟培养基。优选地，其中所述诱导培养基包含：细胞骨架蛋白抑制剂、N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇。优选地，其中所述成熟培养基包含：N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇，神经营养素(NT3)，脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。本专利技术还提供了细胞骨架蛋白抑制剂用于制备抗肿瘤药物、组织再生和/或修复药物中的用途。根据本专利技术的一个实施方式，本专利技术的敲低处理包括以下的至少一种：采用与序列SEQIDNO:1具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock1基因表达，采用与序列SEQIDNO:2具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的rock2基因表达，采用与序列SEQIDNO:3具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc1基因表达，采用与序列SEQIDNO:4具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc2基因表达，采用与序列SEQIDNO:5具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc3基因表达，采用与序列SEQIDNO:6具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh9基因表达，采用与序列SEQIDNO:7具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的myh10基因表达，采用与序列SEQIDNO:8具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的siRNA敲低胞外基质-骨架系统中的mrckα基因表达，采用与序列SEQIDNO:9具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的si本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将非神经元细胞转分化为神经元细胞的方法，其特征在于所述方法包括对所述非神经元细胞的胞外基质‑骨架系统进行干扰处理。

【技术特征摘要】
1.一种将非神经元细胞转分化为神经元细胞的方法，其特征在于所述方法包括对所述非神经元细胞的胞外基质-骨架系统进行干扰处理。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干扰处理选自以下的至少一种：采用细胞骨架蛋白抑制剂进行处理，采用小干扰RNA(siRNA)对胞外基质-骨架系统的基因表达进行敲低处理，对胞外基质进行低粘附处理并定向培养。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种：肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂；优选地，其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种：(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7，所述肌球蛋白(myosin)抑制剂浓度为10μM以上，优选20μM以上，更优选10-30μM，其中所述浓度为所述肌球蛋白(myosin)抑制剂在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的浓度；优选地，其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种：CytochalasinB、LatrunculinB，其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上，优选2μM以上，更优选2-3μM，LatrunculinB浓度为0.15μM以上，优选0.2μM，更优选0.2-0.3μM，其中所述浓度为所述抑制剂CytochalasinB或LatrunculinB在处理非神经元细胞所用诱导培养基中的浓度。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述方法包括将非神经元细胞置于诱导培养基中培养3-7天，然后采用成熟培养基培养7-14天；优选地，其中所述诱导培养基包含：所述细胞骨架蛋白抑制剂、N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇；优选地，其中所述成熟培养基包含：N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇，神经营养素(NT3)，脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述非神经元细胞为成纤维细胞和/或神经胶质细胞。6.细胞骨架蛋白抑制剂用于将非神经元细胞转分化为神经元细胞的用途。7.一种将非神经元细胞转分化为神经元细胞的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括诱导培养基，所述诱导培养基包含细胞骨架蛋白抑制剂。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述细胞骨架蛋白抑制剂选自以下的至少一种：肌球蛋白(myosin)抑制剂、肌动蛋白(actin)组装抑制剂；优选地，其中所述肌球蛋白(myosin)抑制剂选自以下的至少一种：(-)-Blebbistatin、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7，浓度为10μM以上，优选20μM以上，更优选10-30μM，其中所述浓度为所述所述肌球蛋白(myosin)抑制剂在诱导培养基中的浓度；优选地，其中所述肌动蛋白(actin)组装抑制剂选自以下的至少一种：CytochalasinB、LatrunculinB，其中CytochalasinB的浓度为1.5μM以上，优选2μM以上，更优选2-3μM，LatrunculinB浓度为0.15μM以上，优选0.2μM，更优选0.2-0.3μM，其中所述浓度为所述抑制剂CytochalasinB或LatrunculinB在诱导培养基中的浓度。9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括成熟培养基，优选地，其中所述诱导培养基还包含：N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇；优选地，其中所述成熟培养基包含：N2细胞培养基添加剂，B27细胞培养基添加剂，谷氨酰胺，β巯基乙醇，神经营养素(NT3)，脑源性神经营养因子(BDNF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，二丁酰环腺苷酸(db-cAMP)。10.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述非神经元细胞为成纤维细胞和/或神经胶质细胞。11.细胞骨架蛋白抑制剂在制备抗肿瘤药物、组织再生和/或修复药物中的用途。12.根据权利要求2所述的方法，其中所述敲低处理包括以下的至少一种：采用与序列SEQIDNO:1具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的rock1基因表达，采用与序列SEQIDNO:2具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的rock2基因表达，采用与序列SEQIDNO:3具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc1基因表达，采用与序列SEQIDNO:4具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc2基因表达，采用与序列SEQIDNO:5具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的mrlc3基因表达，采用与序列SEQIDNO:6具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的myh9基因表达，采用与序列SEQIDNO:7具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的myh10基因表达，采用与序列SEQIDNO:8具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的mrckα基因表达，采用与序列SEQIDNO:9具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的mrckβ基因表达，采用与序列SEQIDNO:10具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低胞外基质-骨架系统中的lamina/c基因表达，采用与序列SEQIDNO:11具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的小干扰RNA(siRNA)敲低...

【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，李伟，胡宝洋，何正泉，王柳，郝捷，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11