本发明专利技术公开了抗PD‑L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20所示。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述抗PD‑L1纳米抗体具有高度特异性，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。
【技术实现步骤摘要】
抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用
本专利技术属于生物医学
，涉及一种新的PD-L1抗体或其功能性片段，具体为抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用。
技术介绍
程序性死亡因子1配体1(programmeddeath1ligand1，PD-L1)又称CD274，B7-H1，为B7家族成员，是PD-1的配体，属于I型跨膜蛋白。在正常情况下，T细胞表面的PD-1能够抑制T淋巴细胞的功能，从而抑制自身免疫应答，防止自身免疫性疾病的发生。但在肿瘤中，肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表面的PD-1结合后，能通过对T淋巴细胞的抑制作用，导致T细胞增殖下调,甚至诱导T细胞凋亡,促进肿瘤的免疫逃逸。而阻断PD-1/PD-L1负调控通路,可激活免疫系统功能，杀伤肿瘤细胞。目前市面上已有多种靶向PD-L1单克隆抗体，如罗氏PD-L1单克隆抗体atezolizumab(Tecentriq)，阿斯利康公司研发的Durvalumab(商品名：Imfinzi)，辉瑞/默克的avelumab(商品名：Bavencio)，这些PD-L1单抗在临床中已经取得成功应用。但是单克隆抗体具有开发周期长，生产成本高，分子量大，难以穿透组织等缺点。这些因素均限制了其在临床应用中的普及，而纳米抗体是目前最小的抗体分子，具有稳定性好，成本低，水溶性好，可穿过血脑屏障等优点。而且选择wasabi作为表达纳米抗体的融合片段，具有表达量高，成本低,便于检测应用等优点。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种检测敏感度高，稳定性好，成本低，易于实际应用的纳米抗体，本专利技术提供了抗PD-L1纳米抗体及其编码序列、制备方法和应用。技术方案：抗PD-L1纳米抗体，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:11或SEQIDNO:20所示。抗PD-L1纳米抗体，所述抗体VHH链包括框架区和互补决定区；其中：所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:3，FR2、SEQIDNO:5，FR3、SEQIDNO:7，FR4、SEQIDNO:9；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:4，CDR2、SEQIDNO:6，CDR3、SEQIDNO:8；或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:12，FR2、SEQIDNO:14，FR3、SEQIDNO:16，FR4、SEQIDNO:18；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:13，CDR2、SEQIDNO:15，CDR3、SEQIDNO:17；或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:21，FR2、SEQIDNO:23，FR3、SEQIDNO:25，FR4、SEQIDNO:27；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:22，CDR2、SEQIDNO:24，CDR3、SEQIDNO:26。编码抗PD-L1纳米抗体的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1、SEQIDNO:10或SEQIDNO:19。重组载体，所述重组载体中包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:10或SEQIDNO:19序列。宿主细胞，所述宿主细胞中包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:10或SEQIDNO:19序列。以上所述抗PD-L1纳米抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)构建抗PD-L1纳米抗体噬菌体文库；(2)选择与PD-L1具有特异结合的纳米抗体噬菌体；(3)培养包含编码抗PD-L1纳米抗体核酸的载体的宿主；(4)从宿主细胞中纯化获得抗PD-L1纳米抗体。优选的，采用巢式PCR方法构建抗PD-L1纳米抗体的文库，其中第一轮扩增反应引物序列为SEQIDNO:28-29，第二轮扩增反应引物序列为SEQIDNO:30-31。免疫偶联物，该免疫偶联物含有抗PD-L1纳米抗体的VHH链或抗PD-L1纳米抗体；和wasabi蛋白。以上所述的抗PD-L1纳米抗体在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备治疗肿瘤药物中的应用。以上所述的免疫偶联物在(a)制备检测PD-L1的试剂盒；(b)制备治疗肿瘤药物中的应用。本专利技术所述抗PD-L1纳米抗体的实验原理在于：采用基因工程技术，将PD-L1免疫后的骆驼血清中重链抗体可变区基因展示于T7噬菌体表面，再利用PD-L1从噬菌体抗体库中筛选出特异识别PD-L1的噬菌体表面的纳米抗体，由于所展示的纳米抗体与其所对应的基因存在于同一个重组噬菌体内，获得特异识别PD-L1的噬菌体纳米抗体后，通过对该噬菌体的DNA进行PCR扩增，测序即可获得该重组噬菌体内的纳米抗体对应基因。有益效果：(1)本专利技术所述抗PD-L1纳米抗体具有高度特异性，检测敏感性高；(2)所述抗体能够在大肠杆菌中高效表达，因而为后续的免疫试剂及肿瘤药物组合物的量产化生产提供基础。附图说明图1A为nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNAmarker；1为nest-PCR1产物；图1B为nest-PCR2产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNAmarker；1为nest-PCR2产物；图1C为抗PD-L1纳米抗体文库多样性鉴定图，其中M为DNA分子标准；1-10为抗PD-L1纳米抗体文库中随机挑选的单克隆噬菌体PCR产物；图2为免疫偶联物wasabi-antiPD-L1Nb28、wasabi及3种抗PD-L1纳米抗体的SDS-PAGE图，其中，M为分子量标准，1为wasabi-antiPD-L1Nb28蛋白，2为wasabi蛋白，3-5为antiPD-L1Nb15、antiPD-L1Nb22、antiPD-L1Nb28；图3为酶联免疫法鉴定纳米抗体的特异性结果图；图4为纳米抗体检测HEK293T/PD-L1荧光图。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例11抗PD-L1纳米抗体文库构建(1)将1mg带有His标签的PD-L1胞外段(19-239)抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫5次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)逆转录PCRI.采用RT-PCR试剂盒，将外周血淋巴细胞总RNA逆转录成cDNA，II.通过nest-PCR扩增cDNA,得到骆驼重链抗体的VHH片段。以上述所得的cDNA为模板，nest-PCR1up(SEQIDNO:28)和nest-PCR1down(SEQIDNO:29)为引物，进行第一轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶电泳结果显示，扩增基因片段在700bp处有特异性条带。切胶回收目的条带(见图1A)。以回收产物为模板，nest-PCR2up(SEQIDNO:30)和nest-PCR2down(SEQIDNO:31)为引物，进行第二轮PCR扩增。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗PD‑L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:20所示。
【技术特征摘要】
1.抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体VHH链的氨基酸序列如SEQIDNO:2、SEQIDNO:11或SEQIDNO:20所示。2.抗PD-L1纳米抗体，其特征在于，所述抗体VHH链包括框架区和互补决定区；其中：所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:3，FR2、SEQIDNO:5，FR3、SEQIDNO:7，FR4、SEQIDNO:9；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:4，CDR2、SEQIDNO:6，CDR3、SEQIDNO:8；或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:12，FR2、SEQIDNO:14，FR3、SEQIDNO:16，FR4、SEQIDNO:18；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:13，CDR2、SEQIDNO:15，CDR3、SEQIDNO:17；或者，所述框架区包括以下4段氨基酸序列：FR1、SEQIDNO:21，FR2、SEQIDNO:23，FR3、SEQIDNO:25，FR4、SEQIDNO:27；所述互补决定区包括以下3段氨基酸序列：CDR1、SEQIDNO:22，CDR2、SEQIDNO:24，CDR3、SEQIDNO:26。3.编码抗PD-L1纳米抗体的基因，其特征在于，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：李淑锋，姜昆鹏，王婷，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。