【技术实现步骤摘要】
一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法
本专利技术属于多组分生化药技术分析领域,具体涉及一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法。
技术介绍
转移因子(transterfactor,简称TF)又称传输因子,是一种天然双向免疫调节剂,是目前治疗免疫功能低下、缺陷等相关疾病的理想药物。转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和核糖核酸。准确测定转移因子中的核糖核酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。从健康猪脾脏提取分离的核糖核酸(RNA),是由几十至几千个核苷酸聚合而成的长链,每一种RNA都有一定的核苷酸排列顺序和二级、三级结构。现有技术核糖核酸含量测定的方法采用紫外吸收系数法,但因一方面样品中的杂蛋白和苯酚等在相同波长处均有吸收,干扰测定结果;另一方面RNA片段的长短以及二级结构状态会对吸光度值产生较大影响,导致测定结果不准确。查阅相关文献,有采用高效液相色谱法测定核糖核酸含量的文献报道,但一般采用离子对-HPLC法或者离子色谱法进行分离,且只用于单独分离核苷酸或脱氧核苷酸。离子对色谱法平衡时间较长,且色谱峰容易漂移,色谱柱使用寿命短。如上所述,目前关于核糖核酸含量测定的研究尚少,因此目前法定对照品仅有4种脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸),其他4种核苷酸(腺嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸)及4种核苷(腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷)暂无法定对照品。
技术实现思路
为了克服上述现有技术存在的缺陷,本专利技术的目的在于提供一种转移 ...
【技术保护点】
1.一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解,获得转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液;2)构建核糖核酸的标准曲线方程以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品,配制线性系列溶液,利用高效液相色谱法检测获得色谱图,以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归,得到标准曲线方程及线性相关系数;其中,高效液相色谱检测条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱;以流动相A和流动相B进行梯度洗脱,其中:流动相A为甲醇;流动相B为pH值为3.55~3.65、浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液;检测过程中:波长为210~320nm,进样量为1~50μL,流速为0.6~1.0mL/min,柱温为33~37℃;3)转移因子口服液中核糖核酸的检测精密量取步骤1)制得的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液,利用高效液相色谱法在与步骤2)相同的色谱检测条件下获得色谱图,由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质即4种核苷酸和4种核苷的色谱峰;4)转移因子口服液中核苷酸类物质 ...
【技术特征摘要】
1.一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法,其特征在于,包括以下步骤:1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解,获得转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液;2)构建核糖核酸的标准曲线方程以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品,配制线性系列溶液,利用高效液相色谱法检测获得色谱图,以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归,得到标准曲线方程及线性相关系数;其中,高效液相色谱检测条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱;以流动相A和流动相B进行梯度洗脱,其中:流动相A为甲醇;流动相B为pH值为3.55~3.65、浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液;检测过程中:波长为210~320nm,进样量为1~50μL,流速为0.6~1.0mL/min,柱温为33~37℃;3)转移因子口服液中核糖核酸的检测精密量取步骤1)制得的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液,利用高效液相色谱法在与步骤2)相同的色谱检测条件下获得色谱图,由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质即4种核苷酸和4种核苷的色谱峰;4)转移因子口服液中核苷酸类物质的含量计算根据步骤2)获得的标准曲线方程和步骤3)的色谱峰,从标准曲线方程中求出各待测物质的含量,乘以相应的相对校正因子并加和即得核糖核酸含量。2.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法,其特征在于,步骤1)中,采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解,具体操作步骤如下:步骤a:取蛇毒磷酸二酯酶,加缓冲液制成5IU/ml的溶液,每支1.5μl分装,用时加缓冲液13.5μl;所述缓冲液包括110mmol/LTris-HCl,15mmol/LMgCl2,110mmol/LNaCl,pH8.9;步骤b:精密量取转移因子口服溶液3μl,加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μl,涡旋混匀,置37℃反应30min后,加水至100μl,混匀,沸水浴5min,离心15min,取上清液,即完成酶解操作。3.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法,其特征在于,步骤2)中,构建核糖核...
【专利技术属性】
技术研发人员:李小凤,蔡慧侠,郭维真,
申请(专利权)人:金花企业集团股份有限公司西安金花制药厂,
类型:发明
国别省市:陕西,61
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