产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用制造技术

本发明专利技术涉及产2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用，用超分子自组装模板固定大肠杆菌表达的2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌。重组基因工程菌的构建，是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7，构建2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌pTE28aT7‑gldha；超分子自组装模板，是将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为20～35nm的超大比表面积（不小于1000m

【技术实现步骤摘要】
产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用
：本专利技术属于微生物发酵技术，涉及产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用。
技术介绍
2,5-呋喃二甲酸(FDCA)是重要的有机合成中间体，可用来制备各种烷基取代或酯类呋喃衍生物。烷基取代类衍生物广泛应用于合成手性催化剂、分子识别受体和高分子材料中;酯类衍生物是重要香料，主要用在食品、化妆品香精中。此外，2,5-呋喃二甲酸可取代对苯二甲酸制造聚酯类的塑胶材料。在药理学方面，2,5-呋喃二甲酸二乙酯具有与可卡因类似的麻醉作用，2,5-呋喃二甲酸钙盐具有抑制巨大芽孢杆菌的生长的功能。以二甘醇酸为原料，与二氯亚砜和甲醇反应得到二甘醇酸二甲酯，在氢氧化钾作用下，与二水合三聚乙二醛缩合得到2,5-呋喃二甲酸。此法原料不易制备、价格昂贵，合成中用到了二氯亚砜、乙醚、氯仿等危险试剂，后处理常采用柱层析法，不利于工业化生产。以5-羟甲基糠醛为原料，二氧化铈为催化剂，高压(1.01×106Pa)氧化得到2,5-呋喃二甲酸。此法虽然获得较好的收率99%，但原料及催化剂价格昂贵，高压条件对设备要求太高，工业化成本高，不利于实际生产应用。以糠酸为起始原料，先与甲醇反应，经氯甲基化，再水解，最后经高锰酸钾氧化制得2,5-呋喃二甲酸，反应总收率为47.5%。此方法的原料虽较廉价易得，但操作工艺要求高和环境污染较严重。本专利技术是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha；通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7,构建2,5-呋喃二甲酸工程菌pTE28aT7-gldha；在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下，采用超分子自组装模板固定化，在含有果糖的限制培养基中，经深度发酵合成2,5-呋喃二甲酸；通过过滤发酵液、有机溶剂萃取结晶和组合溶剂重结晶,获得产品2,5-呋喃二甲酸。合成工艺路线简捷，既节能又环保，所获得的产品质量高和成本低，总质量收率达到65.5%以上。随着固定化酶技术的发展，越来越多的研究者关注于固定化大肠杆菌酶。固定化大肠杆菌酶具有如下优势：相较于游离酶，固定化酶在催化反应过程中，其质粒更加稳定，目的基因产物活力较高，产物易于分离纯化。自1959年Hattori首次将大肠杆菌酶吸附在树脂上实现了大肠杆菌酶固定化以来，固定大肠杆菌活酶或称为固定化增殖大肠杆菌酶的研究工作相继展开。超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。人们可以根据超分子自组装原则，使用分子间的相互作用力作为工具，把具有特定的结构和功能的组分或建筑模块,按照一定的方式组装成新的超分子化合物。这些新的化合物不仅仅能表现出单个分子所不具备的特有性质，还能大大增加化合物的种类和数目。如果人们能够很好的控制超分子自组装过程，就可以按照预期目标更简单、更可靠的得到具有特定结构和功能的化合物。本专利技术，将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为20～35nm的超大比表面积（不小于1000m2/g）的超分子自组装模板。将上述超分子自组装模板，采用物理吸附法用来固定上述重组基因工程菌，并用于在含果糖限制性培养基中发酵制备2,5-呋喃二甲酸。本专利技术的固定化菌株，产物表达量最高可达130g/L，果糖转化率高于65.5%；重复利用性好，重复利用30次后，产物表达量仍可达105g/L，果糖转化率高于52.90%，将对2,5-呋喃二甲酸的微生物发酵制备具有积极的作用，应用前景广阔。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用。本专利技术是通过下述方法实现的：用超分子自组装模板固定大肠杆菌表达产2,5-呋喃二甲酸的重组基因工程菌。工程菌的构建是将梭菌属甘油脱水酶基因gldABC，整合进土生克雷伯杆菌基因dhaβ,形成重组DNA基因gldha，通过PCR扩增，并经修饰后插入大肠杆菌表达载体pTE28aT7,构建2,5-呋喃二甲酸工程菌pTE28aT7-gldha。质粒子及菌株：克隆载体pTE28aT7-，大肠杆菌E.ColiＪＭ１０９购自商业公司。限制性内切酶，Taq酶，T4DNA连接酶均购自大连宝生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。甘油脱水酶分离培养基：蒸馏水1000mL,果糖6g,NaCl5g,酵母粉7g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（NileRed）2mL/L(0.30mgNileRed溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10g,琼脂粉10g,果糖3g,(NH4)2SO45g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.产品发酵培养基：磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH2PO4.12H2O8.95g，KH2PO41.5g,pH7.0，0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。基因工程菌富集培养基为LB培养基。发酵培养基为添加15.0%果糖的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为33℃。重组DNA基因的获得与重组质粒的构建：按照已发表的梭菌属甘油脱水酶的基因gldABC的cDNA序列，设计正反引物:正向引物Pl(5'-ACGAGGAATTCATGAATTGGCCTACTCG-3');反向引物P2(5'-ATATGCGGCCGCGTGAACAGTAGGCAGAG-3')。正向引物带有EcoRI酶切位点，反向引物带有Not工酶切位点，以引物Pl,P2对重组质粒pUC19-gldABCPCR扩增获得gldABC基因片段。同样，设计土生克雷杆菌的基因dhaβ,正向引物带有BamHI酶切位点，反向引物带有Xoh工酶切位点，以引物Pl’,P2’对重组质粒pUCM-dhaβPCR扩增获得dhaβ基因片段。将上述2种基因片段，在连接酶T4ligase的作用，连接成为重组DNA的基因gldha。经重组DNA质粒的提取、高通量筛选和序列测定后，采用CaCl2质粒重组技术，将重组DNA的基因gldha和载体，转入E.coliJM109的感受态细胞中，转化子测序，得到表达质粒pTE28aT7-gldha。PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：根据钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、130r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。重组基因工程菌的提取：前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入产气气杆菌的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、110r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术涉及产2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用，其特征在于超分子自组装模板固定产2,5‑呋喃二甲酸重组基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.本发明涉及产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌的固定化及其应用，其特征在于超分子自组装模板固定产2,5-呋喃二甲酸重组基因工程菌。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将硅酸钠、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、氯化铵和三氯化铝在水相和超分子自组装条件下，制备的孔径为20～35nm的超大比表面积（不小于1000m2/g）的超分子自组装模板,并在酸性水溶液中结构稳定,合成物体系中各物质的摩尔比为SiO2:CTAB:AlCl3:NH4Cl：H2O=1.0:0.15～0.2:0.5～0.6:1.0～2.0:40～60。3.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：安徽瑞赛生化科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34