本发明专利技术公开了一种甘薯绿原酸合成途径中关键酶基因IbPAL1及应用。所述关键酶基因IbPAL1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。IbPAL1基因编码的蛋白质是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明专利技术从甘薯中分离出编码转录因子IbPAL1的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株，且提高了转基因植物的绿原酸含量。此基因可以应用于植物营养品质的遗传改良。
IbPAL1, a key enzyme gene in the biosynthesis pathway of chlorogenic acid in sweet potato and its application
The invention discloses a key enzyme gene IbPAL1 in the biosynthetic pathway of sweet potato chlorogenic acid and its application. The nucleotide sequence of the key enzyme gene IbPAL 1 is shown as SEQ ID NO.1. The protein encoded by IbPAL1 gene is the amino acid sequence shown in SEQ ID No.2. The complete gene encoding transcription factor IbPAL1 is separated from sweet potato, connected to plant expression vector, transformed plant by Agrobacterium tumefaciens, and obtained transgenic plant, and the chlorogenic acid content of the transgenic plant is increased. This gene can be applied to genetic improvement of plant nutritional quality.
【技术实现步骤摘要】
甘薯绿原酸合成途径中关键酶基因IbPAL1及应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种甘薯绿原酸合成途径中关键酶基因IbPAL1、该基因编码的蛋白质以及含有该基因的重组载体及其应用。
技术介绍
甘薯[Ipomoeabotatas(Lam.)L]属一年生或多年生蔓生草本植物，又名红薯、地瓜、番薯、甜薯等，是世界上重要的粮食、饲料和工业原料作物。甘薯原产于南美洲的热带地区，约在400多年前传入我国。由于它稳定高产、抗灾能力强、适应性广等特性，在我国很快得到普及，占世界甘薯总产量的85.9％，成为仅次于水稻、小麦、玉米之后的粮食作物。甘薯不仅是重要的食物来源，同时也具有重要的药用价值。据《本草纲目》等文献记载，甘薯具有补虚乏、益气力、健脾胃、强肾阳等功效，可以补中和血、益气生津、宽肠胃、通便秘，主治脾虚水肿，肠燥便秘。因此，研究甘薯中的有效活性成分及其营养保健作用，为开发利用甘薯资源提供理论依据具有着重要意义。近年来，随着对甘薯营养成分的深入研究，发现甘薯中含有丰富的营养物质和一些功能性成分，与常见主粮作物及蔬菜相比营养成分齐全，许多有益成分含量甚至都高于它们。除含量丰富的蛋白质、糖类、维生素和矿物质外，甘薯中还含有大量绿原酸。绿原酸(Chlorogenicacid)，又名咖啡单宁酸，化学名为3-O-咖啡酰奎宁酸(3-O-caffeoylquinicacid)，分子式C16O18H9，是由咖啡酸(caffeacid)与奎宁酸(quinicacid)组成的缩酚酸，属于植物体内有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类次生代谢产物。近年已发现绿原酸具抗氧化、抗高血压、抗菌、抗肿瘤、抗辐射、降血糖、降血脂、抗炎、补肾、保肝等多种药理作用，是许多药材的有效成分。除了药用外，绿原酸还可用于食品工业作食品和果品的保鲜剂。绿原酸广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中，在忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中含量较高，如杜仲、金银花。因此，目前绿原酸的提取及研究主要以金银花和杜仲为原料。甘薯中绿原酸含量虽然低于金银花和杜仲，但其种植范围广，生物量大且价格低廉，因而从甘薯中获取绿原酸具有较好的应用前景。苯基丙氨酸解氨酶基因PAL位于绿原酸合成途径上游，是绿原酸生物合成途径中的关键基因之一。通过运用分子生物学手段对甘薯中IbPAL1基因进行正向调节以控制碳素流向绿原酸合成途径，将明显有助于提高甘薯绿原酸合成及其营养价值，进一步促进植物绿原酸次生代谢工程的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于之一是提供一种甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbPAL1。本专利技术的第二个目的是提供一种该基因编码的蛋白质。本专利技术的第三个目的是提供一种含有该基因的表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种含有该表达载体的宿主细胞。本专利技术的最后一个目的在于提供该基因的用途。本专利技术的技术方案概述如下：一种甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbPAL1，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，由2130个碱基组成。上述基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由709个氨基酸残基组成。一种含有上述基因的表达载体pCAMBIA1305-IbPAL1，它含有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。一种含有上述表达载体农杆菌宿主细胞EHA105：pCAMBIA1305-2×35s-IbPAL1。上述基因在转化植物获得转基因植株中的应用，尤其是在制备转基因甘薯中的应用。本专利技术的优点：本专利技术从甘薯中分离出甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbPAL1的完整cDNA，连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得转基因植株并对其绿原酸含量进行分析，结果表明IbPAL1基因能够提高甘薯绿原酸合成能力。此基因可以应用于植物营养品质的遗传改良。附图说明图1.IbPAL1氨基酸序列的系统进化树分析结果图2.IbPAL1基因组织中的表达图3.pCAMBIA1305-2×35s-IbPAL1载体示意图图4.未转化的甘薯株系和转IbPAL1基因植株绿原酸含量比较具体实施方式下面将通过具体实施例来对本专利技术进行进一步的解释，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本专利技术的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本专利技术的范围。本专利技术的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。实施例1甘薯绿原酸合成途径关键酶基因IbPAL1序列获得，具体如下：利用OMEGARNA试剂盒，从100mg的新鲜的甘薯叶片中提取总RNA，利用反转录试剂盒(Bioteke)合成cDNA。具体反应体系如下：在PCR仪上按以下条件进行反转录反应：1、50℃，45min；2、70℃，10min；之后冰上冷却。将提取的总RNA送华大基因(BeijingGenomicInstitute，BGI)，通过高通量测序获得甘薯转录组数据库，并通过Denovo拼接获得甘薯Unigene数据库，其中C41375.Contig1_A11与NCBI数据库比对后发现该基因可能参与绿原酸合成。将C41375.Contig1_A11通过OFRFINDER(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在线软件预测基因完成的ORF，并利用PrimerPremier5设计扩增完整ORF引物：IbPAL1(F)：5′TGTTCTTCGGATCACCTC3′IbPAL1(R)：5′CCATCCCACAAACATTACA3′利用TAKARA公司KODFX聚合酶进行扩增，具体步骤如下：反应条件如下：94℃，2min；98℃，10sec；58℃，30sec；68℃，1.5min；68℃，10min；34个循环。使用OMEGADNA纯化试剂盒将PCR产物纯化，纯化后的PCR产物与pEASY-Blunt载体连接(本过程使用TransGEN的pEASY-BluntVectorCloningKit试剂盒)，反应体系如下：IbPAL1基因的cDNA片段4u1，pEASY-Blunt载体1μL。反应条件：25℃，20min。连接产物转化E-Coli.DH5α感受态，涂布在含有40ul25mg/ml的X-Ga1、16ul50mg/ml的IPTG、100mg/mLAmp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，使用菌落PCR法确认pEASY-Blunt载体中插入片段的长度大小，与预期一致。送南京金斯瑞生物科技公司测序获得基因序列SEQIDNO.1。实施例2IbPAL1蛋白序列同源分析，具体如下：测序获得cDNA全长1235bp，ORF为2130bp，编码709个氨基酸SEQIDNO.2，将翻译获得蛋白序列与NCBI蛋白数据进行比对(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，获得了与IbPAL1蛋白序列相似的植物种属同源基因。在多重比较分析的基础上，建立了各同源植物种属基因的系统进化树，详本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种甘薯绿原酸合成途径中关键酶基因IbPAL1，其特征在于，所述关键酶基因IbPAL1是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该基因能够促进甘薯绿原酸合成。
【技术特征摘要】
1.一种甘薯绿原酸合成途径中关键酶基因IbPAL1，其特征在于，所述关键酶基因IbPAL1是SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，该基因能够促进甘薯绿原酸合成。2.权利要求1所述关键酶基因IbPAL1编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质是SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。3.一种含有权利要求1所述关键酶基因I...
【专利技术属性】
技术研发人员：禹阳，边小峰，谢一芝，贾赵东，马佩勇，郭小丁，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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