一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法技术

本发明专利技术涉及文物检测领域，公开了一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法，本发明专利技术先用反向微乳液法制备了碳量子点，用碳量子点标记山羊毛和绵羊毛的二抗，之后用金属盐法和还原法提取现代羊毛和古代毛织品残片，透析、纯化，进行SDS‑PAGE凝胶电泳，用碳量子点溶液进行染色，观察电泳图像。将得到的蛋白条带转移到聚偏氟乙烯膜上，经羊毛一抗和碳量子点标记的二抗孵育后，可在凝胶成像系统中观察到免疫条带，鉴别古代毛织品的羊毛种类。本发明专利技术中化学试剂用量少，反应温和、环保无害；在对古代毛织品进行检测时，具有样品用量少、灵敏、准确、直观等优点。

A Method of Identification of Ancient Wool Fragments Based on Immunoblotting

The invention relates to the field of cultural relic detection, and discloses a method for identifying wool types of ancient woolen fabrics based on Western blotting. The invention firstly uses carbon microdots to prepare carbon quantum dots, and uses carbon quantum dots to mark two resistance of goat hair and wool. After that, the modern wool and ancient wool fabric fragments are extracted by metal salt method and reduction method. Dialysis and purification are carried out to carry out SDS PAGE coagulation. Gel electrophoresis, staining with carbon quantum dot solution, observation of electrophoretic images. The obtained protein bands were transferred to PVDF membrane. After two incubation with wool and carbon dots, the immunological bands were observed in the gel imaging system, and the types of wool in ancient wool fabrics were identified. The method has the advantages of less amount of chemical reagent, mild reaction, environmental protection and harmlessness, and has the advantages of less sample consumption, sensitivity, accuracy and intuition when testing ancient wool fabrics.

【技术实现步骤摘要】
一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法
本专利技术涉及文物检测领域，尤其涉及一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法。
技术介绍
中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品，其数量，还是织造之精美程度都让人叹为观止。研究这些出土毛织品的羊毛种类，可以帮助我们更好地了解古代毛织品的起源和少数民族服饰、民族间的文化交流。在古代毛织品遗存中，羊毛遗存主要表现为毛织品残片，这类遗存长期埋藏在地下环境中，受到水、热、氧气、微生物等环境因素的影响，羊毛角蛋白会发生变性和老化降解。而出土后因环境条件的剧烈变化，进一步加速了纤维的老化，因此，不难想象，在漫长的历史长河中，当年埋入墓葬或者遗址中的毛织品早已经失去原有的形貌，降解成肽段或者氨基酸，肉眼无法识别，且年代越早的证据越难寻觅，给毛织品文物的羊毛种类鉴别带来了很大的困难。目前，普通的分析检测技术，如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，X-衍射分析等，在遇到这种残留物分析时，往往束手无策，国内外对于古代毛织品的鉴定，大多数还停留在对纤维形态的分析上，难以鉴别不同古代毛织品的羊毛种类；因此，寻找一种更为科学的手段来鉴别古代毛织品是非常必要的。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法。利用本专利技术方法对古代毛织品残片进行鉴别时，具有直观、准确、高灵敏性的特点。本专利技术的具体技术方案为：一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法，包括以下步骤：1）碳量子点的制备：将水和十二烷基苯磺酸钠加入到正庚烷中，制得油相溶液；加入生物质焦油水溶液、正丙醇和十二烷基苯磺酸钠，振荡得到反相微乳液；加入十二胺，超声，马弗炉中保温，冷却，破乳，离心，制得碳量子点溶液；然后取一半经透析纯化、冷冻干燥，得到碳量子点。将原本工业生产中应该去除的污染物生物质焦油作为原料，来源丰富，并且解决了污染物处理的问题，起到了变废为宝的作用。用反相微乳液法制备碳量子点溶液，产率远高于一般制备方法，并且碳量子点粒度均匀，尺寸可调。2）碳量子点标记羊毛角蛋白二抗的制备：将碳量子点、碳化二亚胺和二抗加入到9-11mmol/L的磷酸缓冲盐溶液中，在室温条件下搅拌2-3h后，用磷酸缓冲盐溶液对溶液进行多次洗涤离心，得到碳量子点标记羊毛角蛋白二抗。碳量子点经过偶联后，其荧光能力增强，同时也可以避免碳量子点粒子团聚现象。3）用酒石酸将0.03-0.06mol/L的酒石酸钠溶液的pH调为2.5-2.8，将此溶液与350-450μl步骤1）所剩余的碳量子点溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；4）分别称取等质量已被混淆的由山羊毛、绵羊毛和岩羊毛制作的古代毛织品残片作为样品，用去离子水清洗，烘干；分别浸在pH=1.5-2.5的HBr溶液中1-2h，用去离子水搓洗，烘干，分别标记为A，B，C三组；将A，B，C三组以1：15-25的浴比加入含有0.05-0.15mol/L的LiBr和0.02-0.04mol/L的十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8-11，超声，放入微波反应器辐射水解6-8min。十二烷基硫酸钠能够与角蛋白形成巨大的胶束，进而保护生成的-SH被氧化，利于还原反应的发生，防止沉淀，同时由于十二烷基硫酸钠溶液有很大的表面能，从而使羊毛能与还原剂充分接触，使反应时间有效的减少。可以得到分子量高、浓度高的角蛋白溶液。金属盐LiBr对羊毛分子中的氢键有极大的破坏作用，与还原性物质共同作用，可以溶解羊毛提取角蛋白。相较于其他金属盐，LiBr具有更好的溶解率和提取率。超声可以辅助水解，使浊液分散均匀，提高蛋白的提取率。微波可以促进羊毛的溶胀，使溶剂等分子振动，提高分子内能，加大水解效果，使羊毛更易溶解，从而降低后续还原所需温度。因为提取羊毛体系的复杂性，超声、微波水解的效果不同于提取其他蛋白，不能马上体现，其表现在最终溶解率、提取率的增大，和后续还原温度的降低上。并且因为提取羊毛体系的特殊性，超声微波不能像提取其他蛋白一样简单加入提取步骤，温度和时间也需调整，经过反复试验，优化条件，确定将其放在还原前的水解步骤上。5）从反应器中取出，将三个样品分别倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70-90℃，通氮气10-20分钟，缓缓加入10-25ml的2.5-3.5mol/L三(2-羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使羊毛溶解，真空抽滤，去除未溶羊毛及杂质。三(2-羧乙基)膦是一种非常有效的硫醇类还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂相比，三(2-羧乙基)膦是更加高效的二硫键还原剂，其还原效果不易因pH的变化而改变。在使用三(2-羧乙基)膦还原时排除氧气，防止其被空气氧化。6）分别加入20-35g硫酸铵，搅拌均匀，调节滤液pH，离心8-15min，将下层溶液在2-6℃条件下用透析袋透析50-60h；低温真空浓缩至原体积的1/4-1/2，得到羊毛角蛋白提取液A、B、C。用硫酸铵盐析，温度系数小，溶解度大，不易引起蛋白质变性。在冰箱中透析，防止蛋白质在较高温度下脱盐变性析出，更稳定，回收率更高。7)SDS-PAGE凝胶电泳：取羊毛角蛋白提取液A、B、C于2*样品缓冲液按1∶0.8-1.2比例混合，水浴加热于93-97℃下加热1.5-2.5min，使蛋白质变性；样品冷却至室温后，分别取羊毛角蛋白提取液A、B、C10-20μl加入凝胶点样孔，进行SDS-PAGE凝胶电泳；浸入步骤3）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5-3.5h，观察样品的电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2。用碳量子点染凝胶，灵敏度高，电泳图像清晰，分辨率高。解决了传统SDS-PAGE凝胶电泳图像模糊不清的问题。8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的聚偏氟乙烯膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2。使用的聚偏氟乙烯膜先用甲醇浸泡，目的是活化聚偏氟乙烯膜上面的正点基团，使它更容易与带负电的蛋白质结合。9）膜成像：电转移完成后，取出聚偏氟乙烯膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况。对膜进行成像，观察蛋白条带的转移情况，方便掌握实验进度，优化实验步骤。10）封闭：取出聚偏氟乙烯膜，用10-20mL的三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜4-6min，用封闭液在室温条件下处理50-70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950-1050:1的体积比稀释山羊毛一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8-12mL稀释的碳量子点标记羊毛二抗中室温条件下孵育1-2h；膜2用绵羊毛抗体进行同样处理；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用碳量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为山羊毛纺织品残片，膜2中得到荧光条带的为绵羊毛纺织品残片，则另一样品即为岩羊毛纺织品残片。作为优选，步骤1）中，碳量子点的制备方法具体如下：向15-25mL有机溶剂正庚烷中，加入摩尔质量比为18-22:1的水和十二烷基苯磺酸钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法，其特征在于包括以下步骤：1）碳量子点的制备：将水和十二烷基苯磺酸钠加入到正庚烷中，制得油相溶液；加入生物质焦油水溶液、正丙醇和十二烷基苯磺酸钠，振荡得到反相微乳液；加入十二胺，超声，马弗炉中保温，冷却，破乳，离心，制得碳量子点溶液；然后取一半经透析纯化、冷冻干燥，得到碳量子点；2）碳量子点标记羊毛角蛋白二抗的制备：将碳量子点、碳化二亚胺和二抗加入到9‑11mmol/L的磷酸缓冲盐溶液中，在室温条件下搅拌2‑3 h后，用磷酸缓冲盐溶液对溶液进行多次洗涤离心，得到碳量子点标记羊毛角蛋白二抗；3）用酒石酸将0.03‑0.06 mol/L的酒石酸钠溶液的pH调为2.5‑2.8，将此溶液与350‑450μl步骤1）所剩余的碳量子点溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；4）分别称取等质量已被混淆的由山羊毛、绵羊毛和岩羊毛制作的古代毛织品残片作为样品，用去离子水清洗，烘干；分别浸在pH =1.5‑2.5的HBr溶液中1‑2h，用去离子水搓洗，烘干，分别标记为A，B，C三组；将A，B，C三组以1：15‑25的浴比加入含有0.05‑0.15mol/L的LiBr和0.02‑0.04mol/L的十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8‑11，超声，放入微波反应器辐射水解6‑8min；5）从反应器中取出，将三个样品分别倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70‑90℃，通氮气10‑20分钟，缓缓加入10‑25ml的2.5‑3.5 mol/L 三(2‑羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使羊毛溶解，真空抽滤，去除未溶羊毛及杂质；6）分别加入20‑35g硫酸铵，搅拌均匀，调节滤液pH，离心8‑15min，将下层溶液在2‑6℃条件下用透析袋透析50‑60h；低温真空浓缩至原体积的1/4‑1/2，得到羊毛角蛋白提取液A、B、C；7) SDS‑PAGE凝胶电泳：取羊毛角蛋白提取液A、B、C于2*样品缓冲液按1∶0.8‑1.2比例混合，水浴加热于93‑97℃下加热1.5‑2.5 min，使蛋白质变性；样品冷却至室温后，分别取羊毛角蛋白提取液A、B、C 10‑20μl加入凝胶点样孔，进行SDS‑PAGE凝胶电泳；浸入步骤3）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5‑3.5h，观察样品的电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2；8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的聚偏氟乙烯膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2；9）膜成像：电转移完成后，取出聚偏氟乙烯膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10）封闭：取出聚偏氟乙烯膜，用10‑20mL的三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜4‑6min，用封闭液在室温条件下处理50‑70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950‑1050:1的体积比稀释山羊毛一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2 h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8‑12mL稀释的碳量子点标记羊毛二抗中室温条件下孵育1‑2 h；膜2用绵羊毛抗体进行同样处理；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用碳量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为山羊毛纺织品残片，膜2中得到荧光条带的为绵羊毛纺织品残片，则另一样品即为岩羊毛纺织品残片。...

【技术特征摘要】
1.一种基于免疫印迹法鉴定古代毛织品残片羊毛种类的方法，其特征在于包括以下步骤：1）碳量子点的制备：将水和十二烷基苯磺酸钠加入到正庚烷中，制得油相溶液；加入生物质焦油水溶液、正丙醇和十二烷基苯磺酸钠，振荡得到反相微乳液；加入十二胺，超声，马弗炉中保温，冷却，破乳，离心，制得碳量子点溶液；然后取一半经透析纯化、冷冻干燥，得到碳量子点；2）碳量子点标记羊毛角蛋白二抗的制备：将碳量子点、碳化二亚胺和二抗加入到9-11mmol/L的磷酸缓冲盐溶液中，在室温条件下搅拌2-3h后，用磷酸缓冲盐溶液对溶液进行多次洗涤离心，得到碳量子点标记羊毛角蛋白二抗；3）用酒石酸将0.03-0.06mol/L的酒石酸钠溶液的pH调为2.5-2.8，将此溶液与350-450μl步骤1）所剩余的碳量子点溶液混合均匀，制得碳量子点染胶溶液；4）分别称取等质量已被混淆的由山羊毛、绵羊毛和岩羊毛制作的古代毛织品残片作为样品，用去离子水清洗，烘干；分别浸在pH=1.5-2.5的HBr溶液中1-2h，用去离子水搓洗，烘干，分别标记为A，B，C三组；将A，B，C三组以1：15-25的浴比加入含有0.05-0.15mol/L的LiBr和0.02-0.04mol/L的十二烷基硫酸钠的溶液中浸没，调节pH值到8-11，超声，放入微波反应器辐射水解6-8min；5）从反应器中取出，将三个样品分别倒入三口烧瓶，将三口烧瓶放在恒温水浴锅中，调节水浴温度70-90℃，通氮气10-20分钟，缓缓加入10-25ml的2.5-3.5mol/L三(2-羧乙基)膦溶液，通氮气搅拌，使羊毛溶解，真空抽滤，去除未溶羊毛及杂质；6）分别加入20-35g硫酸铵，搅拌均匀，调节滤液pH，离心8-15min，将下层溶液在2-6℃条件下用透析袋透析50-60h；低温真空浓缩至原体积的1/4-1/2，得到羊毛角蛋白提取液A、B、C；7)SDS-PAGE凝胶电泳：取羊毛角蛋白提取液A、B、C于2*样品缓冲液按1∶0.8-1.2比例混合，水浴加热于93-97℃下加热1.5-2.5min，使蛋白质变性；样品冷却至室温后，分别取羊毛角蛋白提取液A、B、C10-20μl加入凝胶点样孔，进行SDS-PAGE凝胶电泳；浸入步骤3）所得碳量子点染胶溶液，以低速在摇床上振荡2.5-3.5h，观察样品的电泳图像；本实验中一次制作两张样品胶，记为胶1、胶2；8）电转移：将电泳后的胶平铺在经甲醇和电转缓冲液处理过的聚偏氟乙烯膜上，夹在滤纸和海绵中间组装成转运夹层，放入湿式转膜装置中，恒流转膜；可得到两张电转移膜，记为膜1、膜2；9）膜成像：电转移完成后，取出聚偏氟乙烯膜，放入凝胶成像系统中成像，观察蛋白条带转移情况；10）封闭：取出聚偏氟乙烯膜，用10-20mL的三乙醇胺缓冲盐水溶液洗膜4-6min，用封闭液在室温条件下处理50-70min；11）免疫处理：用抗体稀释液以950-1050:1的体积比稀释山羊毛一抗，将膜1浸没在一抗稀释液中，室温条件下摇床孵育1~2h；取出膜1后用TBST液洗膜，之后浸入8-12mL稀释的碳量子点标记羊毛二抗中室温条件下孵育1-2h；膜2用绵羊毛抗体进行同样处理；12）发光显色：直接将免疫处理后的膜1、膜2在凝胶成像系统中成像，利用碳量子点在紫外光照射下发射荧光的性能，得到免疫印迹图像；膜1中得到荧光条带为山羊毛纺织品残片，膜2中得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秉，王钟元，周莲，杨慧，彭志勤，胡智文，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33