一种超灵敏检测小分子物质的方法技术

本发明专利技术提供一种超灵敏检测小分子物质的方法，属于生物技术领域。该方法中待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,包括如下步骤：分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。本发明专利技术超灵敏检测小分子物质的方法，可以快速、高灵敏度的检测多种小分子物质。

A Super Sensitive Method for Detecting Small Molecular Substances

The invention provides a method for ultra-sensitive detection of small molecule substances, which belongs to the field of biotechnology. In this method, the small molecule substances to be detected are one or more of antigens, ligands, biotins, substrates and polysaccharides, including the following steps: using the solid phase carriers of each small molecule to be detected separately; using each fluorescent probe label to identify the substances of each small molecule to be detected through specific action, to obtain fluorescent labels; and carrying each small molecule label to be detected in the solid phase. After the reaction, the solid phase carriers were separated and the fluorescent probes bound to the surface of the solid phase carriers were released. The fluorescent probes were detected by single molecule detection method, and the concentration of each small molecule in the sample solution was calculated according to the standard working curve. The method for ultra-sensitive detection of small molecule substances of the invention can quickly and sensitively detect various small molecule substances.

【技术实现步骤摘要】
一种超灵敏检测小分子物质的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种超灵敏检测小分子物质的方法。
技术介绍
免疫检测通常是指通过抗体与抗原的特异性识别而用抗体(或抗原)来检测抗原(或抗体)的检测方法。这种通过特异性相互识别的检测方法也可以推广到其它物质的检测，如受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。免疫检测的最经典方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。ELISA简单、经济，而且已广泛采用自动化操作，但是ELISA存在一定的局限性：一是灵敏度低，二是无法进行多重检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种超灵敏检测小分子物质的方法，可以快速、高灵敏度的检测小分子物质。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。一种超灵敏检测小分子物质的方法，待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,包括如下步骤：(1)分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；(2)将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；(3)反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；(4)采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。在本专利技术中，当所述待检小分子为抗原时，通过特异性作用识别待检测小分子的物质为抗体；当所述待检小分子为配体时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为受体；当所述待检小分子为底物时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为酶；当所述待检小分子为多糖时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为凝集素；当所述待检小分子为生物素时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为亲和素或链霉亲和素。优选的技术方案中，所述固相载体为高吸附微孔板、磁珠、聚苯乙烯微球、乳胶微球、碳纳米管或金属纳米颗粒。在本专利技术中，通过共价或非共价的方式将各待检测小分子标记在固相载体表面、将荧光探针标记通过特异性作用识别各待检测小分子的物质；所述共价方式包括通过活化羧基与氨基反应、点化学反应、醛基与氨基反应或巯基与马来酰亚胺反应；所述非共价方式为通过物理吸附或通过生物素与亲和素相互作用。优选的技术方案中，通过加入释放缓冲液或者加热的方法释放固相载体表面结合的荧光探针或者通过使用巯基化合物切断二硫键、高碘酸钠氧化切断邻位二羟基或光切割邻位硝基苯衍生物的方法释放固相载体表面结合的荧光探针。在本专利技术中，所述标准工作曲线的自变量为各待检小分子的浓度，因变量为检测信号值。优选的技术方案中，步骤(2)的反应体系中标记在固相载体表面的待检测小分子的终浓度为0.1pg/mL-1mg/mL，荧光标记物的终浓度为0.1pg/mL-1mg/mL,所述反应体系是将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液后形成的。优选的技术方案中，所述小分子物质为黄曲霉毒素B1。本专利技术的有益效果：通过数学建模，建立理论模型研究竞争免疫，申请人发现竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限，从而可以超灵敏地检测目标小分子物质。与传统检测方法如ELISA相比，本专利技术采用先进的免疫磁珠技术，磁珠均匀的分散在待检测溶液中，免疫反应不受扩散限速，待测小分子标记磁珠可以快速高效地和样品中的目标分析物竞争与荧光标记抗体反应，大大缩短免疫反应达到平衡所需的时间。另外，本专利技术将不同发射波长的荧光探针直接连接到不同的检测抗体分子上，合成工艺简单，可以有效提高荧光标记效率，减少磁分离洗涤次数，提高检测灵敏度。同时，用单分子检测技术可以同时定量检测多种荧光标记的检测抗体，实现多重目标物同时检测，降低检测成本。根据本专利技术方法可以制备一系列高灵敏检测试剂盒，用于抗原小分子化合物如真菌毒素、微囊藻素、抗生素、环境有机污染物、氨基酸、寡核苷酸、脂质小分子、荷尔蒙、农药、兽药残留、食品添加剂和芳香族硝基化合物等的检测。附图说明图1显示了本专利技术超灵敏检测小分子方法的原理。图2显示了本专利技术检测多目标物的原理。图3显示了用共价和非共价方式荧光标记检测抗体。图4是解离磁珠上的免疫复合物(a)或切断荧光标记物(b)的示意图。图5是单分子计数装置的结构示意图。图6是黄曲霉毒素B1检测的标准曲线，横坐标为黄曲霉素B1浓度，纵坐标为归一化响应值(I/I0)。具体实施方式实施例1本专利技术方法检测的小分子物质是指是可以通过特异性作用被其他物质识别的物质，如可以被抗体识别的抗原，可以被受体识别的配体，可以被酶识别的底物，可以被凝集素识别的多糖，可以被亲和素或链霉亲和素识别的生物素。因原理相同，以抗体-抗原免疫反应为例，来证明竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限。通过数学建模，建立理论模型研究竞争免疫分析，申请人发现竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限。IC50是衡量竞争免疫分析灵敏度最主要的参数，通过理论计算，我们发现可以通过降低检测抗体浓度，降低标记抗原浓度，使用高亲和性抗体三种方法来降低IC50，从而提高检测的灵敏度。基于此理论，我们进行了实验验证，理论与实际结果符合，该方法切实有效。推导过程如下：竞争免疫分析是基于目标抗原(Ag)与标记的目标抗原(Ag*，以下缩写为标记抗原)竞争结合检测抗体(Ab)有限的结合位点。通常，控制检测抗体和标记抗原的浓度不变，由于竞争抑制，随着目标抗原浓度的逐渐增加，越来越少的标记抗原与检测抗体结合，检测信号逐渐降低。因此，对于竞争免疫分析，目标抗原的浓度与检测信号一般成负相关。竞争免疫在达到热力学平衡时遵循下面两个方程：其中Kd是目标抗原-检测抗体免疫复合物的解离常数，[AbAg]是目标抗原-检测抗体免疫复合物的浓度，[Ab]为自由检测抗体的浓度，[Ag]是自由目标抗原的浓度，*代表相应的标记抗原。因为目标抗原(Ag)与标记抗原(Ag*)结构类似，所以我们设定：Kd*＝Kd(3)，将(3)代入(1)、(2)得到：另外，[Ag0]＝[Ag]+[AbAg](5)[Ag0*]＝[Ag*]+[AbAg*](6)[Ab0]＝[Ab]+[AbAg]+[AbAg*](7)其中[Ag0]是目标抗原的初始浓度，即样品中目标分析物的浓度。[Ag0*]是加入的标记抗原的初始浓度，[Ab0]是加入的检测抗体的初始浓度。将方程5-6代入方程4可得到：因此，得到根据方程1、2、3和9得到：因此，所以，当目标分析物浓度为0时，假定[AbAg*]＝a,则：根据定义，检测信号为0.5a对应的目标抗原浓度即为半抑制浓度IC50。通过理论计算分析，专利技术人发现，竞争免疫分析的灵敏度(IC50)存在理论最小值即Kd。可以通过三种方法降低IC50，从而提高免疫分析的灵敏度：(1)降低检测抗体浓度，从而减小a的值，提高检测灵敏度；(2)降低标记抗原初始浓度[Ag0*]，从而降低IC50，提高灵敏度；(3)使用高亲和性抗体，抗体亲和性越高，Kd值越小。在传统ELISA中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超灵敏检测小分子物质的方法，待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,其特征在于包括如下步骤：（1）分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；（2）将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；（3）反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；（4）采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。

【技术特征摘要】
1.一种超灵敏检测小分子物质的方法，待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,其特征在于包括如下步骤：（1）分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；（2）将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；（3）反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；（4）采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。2.根据权利要求1所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于：当所述待检小分子为抗原时，通过特异性作用识别待检测小分子的物质为抗体；当所述待检小分子为配体时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为受体；当所述待检小分子为底物时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为酶；当所述待检小分子为多糖时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为凝集素；当所述待检小分子为生物素时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为亲和素或链霉亲和素。3.根据权利要求1或2所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于所述固相载体为高吸附微孔板、磁珠、聚苯乙烯微球、乳胶微球、碳纳米管或金属纳米颗粒。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军，王旭，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32