结合死亡受体4和死亡受体5的高效抗体制造技术

本发明专利技术涉及结合死亡受体4和/或死亡受体5的单克隆抗体，包括所述抗体的药物组合物，以及对患者给予所述药物组合物的治疗方法。

Efficient antibody binding to death receptor 4 and death receptor 5

The present invention relates to a monoclonal antibody combining death receptor 4 and/or death receptor 5, including a pharmaceutical composition of the antibody, and a therapeutic method for a patient to be given the pharmaceutical composition.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】结合死亡受体4和死亡受体5的高效抗体相关申请的交叉引用本申请主张于2015年10月30日提交的US62/248,782的权益，为了一切目的，在此通过引用一并结合。
本专利技术整体涉及单克隆抗体(mAb)和用于开发新生物制剂的重组DNA技术的组合，更具体地，涉及例如结合并活化死亡受体4和5的单克隆抗体的生产。
技术介绍
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL，也称为Apo2配体，还称为Apo2L或Apo2L/TRAIL)是TNF配体超家族的成员(综述于IAMvanRoosmalen等，BiochemPharmacol91:447-456，2014)。TRAIL以刺激依赖性方式在免疫系统的许多细胞上表达并调节免疫应答，例如作为NK细胞介导的细胞毒性中的关键效应分子(CFalschlehner等，Immunol127：145-154,2009)。TRAIL通过与细胞膜受体死亡受体4(DR4，也称为TRAIL-R1)和/或死亡受体5(DR5，也称为TRAIL-R2或Apo2)结合来激活外源性凋亡途径，从而诱导杀死易感细胞。更具体地说，这种有活性的、可溶形式的TRAIL是自组装的、非共价的同源三聚体，它以高亲和力结合三种受体分子的胞外结构域。这种结合诱导细胞内死亡结构域的寡聚化，和同聚或异聚复合物的形成(FCKischkel等，Immunity12：611-620,2000)，随后募集具有死亡结构域(FADD)的Fas相关蛋白，并形成死亡诱导信号复合体(DISC)。该死亡诱导信号复合体能导致半胱天冬酶的激活，然后是凋亡，细胞程序性死亡(参见vanRoosmalen等.,如前文所引用)。许多癌细胞表达了DR4和/或DR5，并且TRAIL能够选择性诱导癌细胞的凋亡(综述于JLemke等，CellDeathDiffer21：1350-1364，2014)以及在肿瘤内皮细胞呈交联形式(NSWilson等，CancerCell22:80-90，2012)。TRAIL本身和各种TRAIL受体激动剂已经被证明对癌细胞系和临床前模型具有强抗肿瘤活性(例如，AAshkenazi等，JClinInvest104:155-162,1999)。这些包括由人TRAIL的胞外区组成的重组人TRAIL(rhTRAIL；dulanermin)(RPitti等，J.BiolChem271：12687-12690,1996)和许多针对DR4或DR5的激动剂单克隆抗体(mAb)，包括鼠源的，嵌合的，人源化的和人单克隆抗体(mAbs)(参见vanRoosmalen等，如前所引)。此类mAb包括针对DR4的4H6.17.8mAb(本文称为4H6；美国专利No.7,252,994)和mapatumumab(HGS-ETR1；Pukac等，BrJCancer92:1430-1441,2005)；以及针对DR5的3H3.14.5mAb(本文称为3H3；美国专利No.6,252,050)、conatumumab(AMG655；PKaplan-Lefko等，CancerBiolTher9:618-631,2010)、drozitumab(Apomab；CAdams等.,CellDeathDiffer15:751-761,2008)、lexatumumab(HGS-ETR2；GGeorgakis等，BrJHaematol130：501-510,2005)和TRA-8及其人源化形式的tigatuzumab(CS-1008，AYada等.,AnnOncol19:1060-1067,2008)；以及vanRoosmalen所列的其他mAbs(如前所引，见第450页的表1)。然而，尽管所有这些药物在体外以及通常的动物模型中能够非常有效地杀死肿瘤细胞(参见上文引用的参考文献)，但是它们中的任何一种在临床试验中都没有表现出强的活性，无论是单独使用还是与其他药剂组合使用，并且没有一种进入III期试验(综述于PMHolland，CytokineGrowthFactorRev25:185-193,2014以及Lemke等，如前所引。特别参见Holland的表1和Lemke等的表2和3，和其中引用的参考文献)。对于mAbs，一个原因可能是有交联mAbs的要求，以此寡聚化死亡受体以触发凋亡途径。这样的要求可以通过在体内将mAbs的Fc结构域与免疫细胞上的Fcγ受体(FcγR)结合而体内满足，但浸润肿瘤的免疫细胞可能太少，或者这种结合可能不具有足够高的亲和力。癌细胞也可能表达凋亡蛋白的抑制剂(见Lemke等，如前所引)。为了改善功效，人们正在开发TRAIL的修饰形式，包括与其他蛋白结构域融合以增强稳定性、寡聚和/或靶向(Lemke等，如前所引和Holland，如前所引)。同样地，已开发出了包含多个结合DR4和/或DR5的抗体结构域的结构体(KMiller等，JImmunol170：4854-4861,2003；WWang等，ImmunolCellBiol91:360-367,2013；JEAllen等.，MolCancerTher11:2087-95，2012；HHuet等，CancerRes72abstract3853,2012；WO2014/022592；WO2015/017822)，但这些结构体还没进入临床试验，或是在临床试验中未取得成功(KPPapadopoulos等，CancerChemotherPharmacol；Feb27，2015，PMID：25721064)；它们非常不自然的结构可能会限制它们的临床效用。在另一种方案中，TRAIL和抗DR5mAbAMG655的组合或联合用药比其单独的任一种药剂在体外和体内更有效(JDGraves等.，CancerCell26：177-189,2014)。
技术实现思路
本专利技术提供了与DR4和DR5结合的单克隆抗体(mAb)，如D114和G4.2以及它们的人源化形式。在一个实施方案中，本专利技术提供了包含两对重链和轻链的双特异性单克隆抗体，其中每个重链/轻链对包含一个结合DR4的结构域和一个结合DR5的结构域。在其他实施方案中，本专利技术提供了具有4个结合DR4的结构域或4个结合DR5的结构域的多聚体mAb。在优选的实施方案中，该抗体具有Bs(scFv)4-IgG抗体的形式，该术语定义见下文。在任何双特异性或多聚体mAbs中，每个结合结构域优选为来自人源化的或人mAb，例如D114和G4.2的人源化形式。而且，本专利技术的任何mAb可以含有恒定区，所述恒定区包含增强与细胞Fcγ受体(FcγR)结合的突变，例如FcγRIIb，例如γ-1恒定区中的S267E和/或L328F突变(根据基于EU索引的Kabat编号)，优选两个或更多个此类突变。有利的是，mAb抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。另一方面，本专利技术提供了包含任何这些mAbs的药物组合物。第三个方面，对患者给予这种药物组合物来治疗癌症或其它疾病。附图说明图1A,B。为Bs(scFv)4-IgG抗体形式的结构简图，示出了单独的可变区和恒定区(A)或通过将每个轻链区与各自的重链区折叠在一起形成的结构域(B)。VH1(或VL1)＝第一抗体的重链(或轻链)可变区；对于第二抗体的VH2和VL2同样如此本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与死亡受体结合的单克隆抗体(mAb)，其包含一轻链可变(V)区和一重链V区，该轻链V区具有来自图5A中D114的轻链V区序列的三个CDR，该重链V区具有来自图5B中D114的重链V区序列的三个CDR；或者，其包含一轻链V区和一重链V区，该轻链V区具有来自图5C中G4.2的轻链V区序列的三个CDR，该重链V区具有来自图5D中G4.2的重链V区序列的三个CDR。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.30 US 62/248,7821.一种与死亡受体结合的单克隆抗体(mAb)，其包含一轻链可变(V)区和一重链V区，该轻链V区具有来自图5A中D114的轻链V区序列的三个CDR，该重链V区具有来自图5B中D114的重链V区序列的三个CDR；或者，其包含一轻链V区和一重链V区，该轻链V区具有来自图5C中G4.2的轻链V区序列的三个CDR，该重链V区具有来自图5D中G4.2的重链V区序列的三个CDR。2.根据权利要求1所述的mAb，其是人源化抗体。3.根据权利要求2所述的mAb，其包含一具有与图5A中的HuD114-L1至少90％序列同一性的轻链V区，和一具有与图5B中HuD114-H1或HuD114-H2至少90％序列同一性的重链V区，其中Kabat编号的轻链位置48和71分别被V和Y占据，Kabat编号的重链位置48和71分别被L和A占据；或者，其包含一具有与图5C中的HuG4.2-L1或HuG4.2-L2至少90％序列同一性的轻链V区，和一具有与图5D中HuG4.2-H1或HuG4.2-H2至少90％序列同一性的重链V区，其中Kabat编号的轻链位置4和68分别被L和R占据，Kabat编号的重链位置27,28,30和93分别被L、P、N和T占据。4.根据权利要求2所述的mAb，其包含一具有图5A中的HuD114-L1序列的轻链V区和一具有图5B中的HuD114-H1或HuD114-H2序列的重链V区；或者，其包含一具有图5C中的HuG4.2-L1或HuG4.2-L2序列的轻链V区和一具有图5D中的HuG4.2-H1或HuG4.2-H2序列的重链V区。5.根据权利要求1所述的mAb，其抑制小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。6.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：京振·金，H·帕克，L·王，Y·丁，A·张，M·瓦斯克兹，
申请(专利权)人：银河生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国,US