基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用制造技术

本公开涉及一种基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。该方法表现出较高的选择性和灵敏度，检测限低至0.000005U/mL，即使在单细胞水平也能检测到内源性多核苷酸激酶(PNK)活性。此外，本方法可以进一步用于多核苷酸激酶(PNK)抑制剂的筛选以及复杂生物样品的精确测定。

Constant Temperature Amplification Based on Ligase and Its Application in Detection of Polynucleotide Kinases

The present disclosure relates to a ligase-based isothermal amplification method and its application in the detection of polynucleotide kinases. In the presence of target polynucleotide kinases (PNKs), donor RNA is linked to receptor RNA to form a complete RNA trigger chain, which induces effective double-stranded specific nucleases mediated Taqman probe to cut and release fluorescent groups to produce obvious fluorescent signals. The detection limit is as low as 0.000005U/mL, and endogenous polynucleotide kinase (PNK) activity can be detected even at the single cell level. In addition, this method can be further applied to the screening of polynucleotide kinase (PNK) inhibitors and the accurate determination of complex biological samples.

【技术实现步骤摘要】
基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用
本公开属于生物分析
，具体涉及一种基于连接酶的恒温扩增法及其在多核苷酸激酶检测中的应用。
技术介绍
这里的陈述仅提供与本公开有关的背景信息，而不必然构成现有技术。多核苷酸激酶(PNK)是一种DNA/RNA末端加工酶，催化磷酸基团从腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)转移到DNA/RNA核苷酸的5'羟基末端以产生5'磷酸末端。多核苷酸激酶(PNK)是参与碱基切除修复(BER)和非同源末端修复途径(NHEJ)的主要修复酶。多核苷酸激酶(PNK)活性失调可能干扰细胞修复系统的稳定性并导致一系列疾病，包括神经退行性疾病，脊髓小脑性共济失调和癌症。因此，多核苷酸激酶(PNK)现在被认为是癌症治疗的潜在靶点，开发灵敏检测多核苷酸激酶(PNK)的方法具有重要意义。传统的多核苷酸激酶(PNK)检测方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳法和同位素标记法，然而，这些方法操作过程繁琐、耗时长而且存在放射性污染，这大大限制了它们的广泛应用。最近，以荧光检测，化学发光和电化学检测为基础的各种多核苷酸激酶(PNK)分析方法已经被开发出来，并且这些方法大多数都基于λ核酸外切酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法，其特征是，该方法包括：靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。

【技术特征摘要】
1.一种基于连接酶的恒温扩增法检测多核苷酸激酶的方法，其特征是，该方法包括：靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，供体RNA与受体RNA连接以形成完整的RNA触发链，RNA触发链诱导有效的双链特异性核酸酶介导的Taqman探针切割释放荧光基团产生明显的荧光信号。2.如权利要求1所述的方法，其特征是：具体的，靶标多核苷酸激酶(PNK)存在时，催化5'羟化的供体RNA的磷酸化以产生5'磷酸化的供体RNA，其可以与3'羟化受体RNA连接以形成完整的RNA触发链；RNA触发链与Taqman探针完全互补，形成RNA触发剂/Taqman探针双链体杂交体，Taqman探针被双链特异性核酸酶(DSN)特异性割，Taqman探针两端的荧光基团与淬灭基团分离并产生荧光信号,释放的RNA触发链可结合新的Taqman探针，开始新一轮切割，循环放大信号；当不存在多核苷酸激酶(PNK)时，5'羟化供体RNA不能与3'羟化受体RNA连接，不能切割DNATaqman探针释放荧光基团，因此不能检测到荧光信号。3.如权利要求1所述的方法，其特征是，具体的包括以下步骤：1)制作标准曲线：将水、双链特异性核酸酶(DSN)缓冲液、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)和供体RNA混合，再分别加入不同质量的多核苷酸激酶，混合均匀进行磷酸化反应，灭活；灭活后，加入Taqman探针、受体RNA和RNA连接酶进行连接反应；连接反应结束后，加入双链特异性核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：张春阳，马飞，刘欢，
申请(专利权)人：山东师范大学，
类型：发明
国别省市：山东,37