荧光原位杂交探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。本发明专利技术的荧光原位杂交探针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的荧光原位杂交探针，专门针对基因组非重复区设计，可以降低非特异反应，减少背景干扰；构建的探针是单链DNA，较之传统的BAC或PCR产物等双链探针，可以减少探针与自身的配对，增加杂交效率；并且构建的单链DNA探针片段小，可以更加快速的与靶向序列结合，减少杂交时间。

Fluorescence in situ hybridization probe and its preparation and Application

The invention discloses a fluorescence in situ hybridization probe, a preparation method and application thereof. The preparation method of the fluorescent in situ hybridization probe and the fluorescent in situ hybridization probe prepared by the method are designed specifically for the non-repetitive region of genome, which can reduce the non-specific reaction and background interference. The constructed probe is single-stranded DNA, which can reduce the pairing of the probe with itself and increase the hybridization efficiency compared with the traditional double-stranded probes such as BAC or PCR products. Moreover, the constructed single-stranded DNA probe fragment is small, which can bind to the target sequence more quickly and reduce the hybridization time.

【技术实现步骤摘要】
荧光原位杂交探针及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学检测领域，尤其是涉及一种荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。
技术介绍
荧光原位杂交技术(Fluorescenceinsituhybridization，FISH)是根据已知种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的DNA片段作为探针，与细胞基因组中DNA分子杂交，检测该特异DNA的存在与丰度。FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析。FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点，不但能显示中期分裂相，还能显示于间期核。目前商业化的HER2等基因FISH检测主要使用BAC(BacterialArtificialChromosome)或者PCR产物作为探针经过荧光分子标记后进行杂交检测。然而，BAC和PCR产物探针存在一些非特异序列，探针特异性不高，信号背景偏高。现有探针片段普遍偏大，一般长度在200-500nt之间，缺乏有效方法进行小片段化，杂交效率偏低，杂交时间长。而且现在探针在标记荧光的时候是随机参入荧光，因此每个探针荧光数目不确定，造成每个批次差异比较大。
技术实现思路
基于此，有必要提供一种特异性高、杂交效率高且荧光标记强度高的荧光原位杂交探针及其制备方法和应用。一种荧光原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤：构建探针文库：针对非重复的目标基因区域，连续设计一系列与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针，在候选探针的两端分别加上扩增引物片段，通过芯片合成得到目的探针文库；扩增所述目的探针文库；对扩增产物进行体外转录，制备与所述目的探针文库对应的文库RNA；对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针；对制备的单链DNA探针进行荧光标记，即得。在其中一个实施例中，所述候选探针的长度为40-50nt。在其中一个实施例中，所述扩增引物片段的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。在其中一个实施例中，使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。在其中一个实施例中，在乳液PCR扩增时，将配制的PCR反应体系分成多份，并分别在热循环仪上进行PCR反应，反应结束后合并部分或全部PCR产物进行后续处理。在其中一个实施例中，在对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针时，包括向反应体系中加入氨基dNTP进行探针标记的步骤，得到的单链DNA探针标记有氨基。在其中一个实施例中，在对制备的单链DNA探针进行荧光标记时，是使用荧光染料标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯与氨基标记的单链DNA探针反应对所述单链DNA探针进行荧光标记。一种荧光原位杂交探针，采用上述任一实施例所述的荧光原位杂交探针的制备方法制备得到。一种荧光原位杂交检测芯片，其含有上述荧光原位杂交探针。一种荧光原位杂交检测试剂盒，其含有上述荧光原位杂交探针或含有上述荧光原位杂交检测芯片。上述荧光原位杂交探针的制备方法以及采用该制备方法制备得到的荧光原位杂交探针，专门针对基因组非重复区设计，可以降低非特异反应，减少背景干扰；构建的探针是单链DNA，较之传统的BAC或PCR产物等双链探针，可以减少探针与自身的配对，增加杂交效率；并且构建的单链DNA探针片段小，可以更加快速的与靶向序列结合，减少杂交时间。并且本专利技术创造性的提出通过使用乳液PCR进行单次扩增，扩增产物转录构建文库RNA，再由文库RNA反转录构建得到单链DNA探针，较之传统的直接由探针文库进行PCR扩增得到双链DNA探针，可以充分利用转录和反转录得到线性的单链DNA，在探针文库扩增过程中，不会存在非特异性的扩增，降低偏向性扩增，可以提高探针的均一性，进而有利于提高后续原位杂交的准确性。此外，通过采用反转录掺入氨基-dNTP，然后偶联荧光染料，可以增加每个探针标记的荧光数目，进而有利于增加荧光原位杂交时荧光强度，提高检测结果的准确性和可靠性。附图说明图1为乳液PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的检测结果；图2为Nanodrop检测体外转录获得的RNA的结果；图3为Nanodrop检测探针浓度的结果；图4为对正常细胞的荧光原位杂交的镜检结果。具体实施方式为了便于理解本专利技术，下面将参照相关附图对本专利技术进行更全面的描述。附图中给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。一实施方式的荧光原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤：步骤一：构建探针文库：针对非重复的目标基因区域，连续设计一系列与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针，在候选探针的两端分别加上扩增引物片段，通过芯片合成得到目的探针文库。本实施方式的目标基因区域为基因组的非重复区，通过对非重复区设计候选探针，可以降低非特异性反应，减少背景干扰。在本实施方式中，针对不同的目标基因区域，间隔预设长度构建候选探针，如可以间隔1-10bp的长度来构建候选探针，可以避免探针之间相互干扰，有利于提高检测结果的准确性。优选的，候选探针的长度优选在35-100nt之间，进一步优选在45nt左右，如在40-50nt之间。本实施方式构建的单链DNA探针片段小，可以更加快速的与靶向序列结合，减少杂交时间。在本实施方式中，在得到候选探针后，还包括通过BLAST比对，获得非特异杂交的Tm值，去除非特异Tm值超过预设值的候选探针，并选择非重叠探针作为最终的候选探针的步骤。扩增引物片段可以是各种通用的扩增引物，如在一个具体的实施例中，扩增引物片段的序列如SEQIDNO.1(5’-GGAGGCCGGAGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’)和SEQIDNO.2(5’-CGTGGTCGCGTCTCA-3’)所示。本实施方式所构建探针文库是使用芯片合成技术将构建的目的探针文库在基因芯片上合成。步骤二：扩增所述目的探针文库。具体的，本实施方式是使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。并且在乳液PCR扩增时，将配制的PCR反应体系分成多份，并分别在热循环仪上进行PCR反应，反应结束后合并部分或全部PCR产物进行后续处理。PCR反应可以进行但不限于25-35个循环，可根据具体的探针的长度等情况而定。步骤三：对扩增产物进行体外转录，制备与所述目的探针文库对应的文库RNA。步骤四：对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针。在本实施方式中，在对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针时，包括向反应体系中加入氨基(Amino)dNTP进行探针标记的步骤，得到的单链DNA探针标记有氨基。在一个具体的实施例中，是使用氨基dUTP(Amino-dUTP)进行探针标记，在其他实施例中，不限于使用氨基dUTP进行标记，也可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建探针文库：针对非重复的目标基因区域，连续设计一系列与目标基因区域完全互补的长度为35nt‑200nt的单链片段作为候选探针，在候选探针的两端分别加上扩增引物片段，通过芯片合成得到目的探针文库；扩增所述目的探针文库；对扩增产物进行体外转录，制备与所述目的探针文库对应的文库RNA；对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针；对制备的单链DNA探针进行荧光标记，即得。

【技术特征摘要】
1.一种荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：构建探针文库：针对非重复的目标基因区域，连续设计一系列与目标基因区域完全互补的长度为35nt-200nt的单链片段作为候选探针，在候选探针的两端分别加上扩增引物片段，通过芯片合成得到目的探针文库；扩增所述目的探针文库；对扩增产物进行体外转录，制备与所述目的探针文库对应的文库RNA；对所述文库RNA进行反转录，制备单链DNA探针；对制备的单链DNA探针进行荧光标记，即得。2.如权利要求1所述的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述候选探针的长度为40nt-50nt。3.如权利要求1所述的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，所述扩增引物片段的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。4.如权利要求1～3中任一项所述的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，使用乳液PCR扩增的方法扩增所述目的探针文库。5.如权利要求4所述的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，在乳液PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：李怡，
申请(专利权)人：广州简册生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44