一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种用于壳斗科植物鲜样和标本的提取和纯化方法，本发明专利技术的提取方法在细胞核裂解之前，加入含有抗坏血酸、Triton‑X 100等的专用漂洗液，不仅能有效去除多糖多酚等杂质，使得到的DNA不再粘稠，还能有效去除色素污染，使所提取的DNA纯度高、产率大，相比核裂解之后再进行除杂的步骤顺序效果更优，适于后期分子实验的应用；本发明专利技术纯化方法采用硅胶粉自制硅胶吸附液，可有效纯化并获得高纯度DNA，能满足下游PCR及酶切实验。本发明专利技术方法克服了传统CTAB法和试剂盒在壳斗科植物提取中的困难，可用于提取壳斗科新鲜叶片、硅胶干燥样及保存年代较长的干燥植物标本样品的DNA，用于高通量测序。

A Method for DNA Extraction and Purification of Fagaceae Plant Samples

The invention discloses a method for extracting and purifying fresh samples and specimens of Fagaceae plants. The extraction method of the invention can not only effectively remove impurities such as polysaccharides and polyphenols, but also effectively remove pigmentation pollution and improve the purity and yield of extracted DNA by adding special rinsing solution containing ascorbic acid and Triton X 100 before nucleus lysis. The purifying method adopts silica gel powder to prepare silica gel adsorbent solution, which can effectively purify and obtain high purity DNA, and can satisfy the practical test of downstream PCR and enzyme. The method overcomes the difficulties of traditional CTAB method and kit in extracting Fagaceae plants, and can be used to extract DNA from fresh leaves of Fagaceae, silica gel dried samples and dried plant specimens preserved for a long time, and for high-throughput sequencing.

【技术实现步骤摘要】
一种壳斗科植物样品DNA提取和纯化方法
本专利技术涉及一种植物DNA的提取和纯化方法，尤其涉及一种富含多糖多酚类的壳斗科植物样品特别是新鲜样品、硅胶干燥样品、标本样品中DNA的提取和纯化方法。
技术介绍
高通量测序技术大多具有数据量大、通用性广和高分辨率等优势，已广泛运用于种质鉴定(Lai，Lietal.2010)、遗传多样性分析(Xia，Guoetal.2009)、遗传图谱构建(Huang，Fengetal.2009)等，成为林木遗传学和分子育种的重要研究工具和手段。壳斗科(Fagaceae)植物是北半球温带和亚热带森林的重要组成，共有8属，约1047种(GovaertsandFrodin1998)。我国有7属，约300多种，自然分布于南北各省区，资源丰富，其树皮和壳斗都富含鞣质，坚果(子叶)含大量淀粉，是重要的木材、坚果、栲胶的资源植物(刘茂松，洪必恭1998)，具有重要的经济价值和生态功能。开展壳斗科植物的遗传多样性分析，对壳斗科植物资源的可持续利用和保护有重要意义。但是，壳斗科植物富含等次生代谢物质，并且这些多糖、多酚会与核酸形成复合物，严重影响了DNA的提取质量，成为高通量本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉；(2)加入专用漂洗液，震荡离心后弃上清，重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线；所述专用漂洗液主要包括如下有效组分：2％～4％PVP，1％～2％L‑Ascorbic Acid，2％～4％Triton‑X 100，4％～5％β‑mercatoeyhanol；(3)加入预热的CTAB提取液，60℃～65℃水浴40～60分钟，每5～10分钟颠倒混匀一次；(4)室温放置冷却2～3分钟后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，离...

【技术特征摘要】
1.一种壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取植物样品，在研磨时加入交联聚乙烯基吡咯烷酮和/或维生素C，液氮快速研磨成粉；(2)加入专用漂洗液，震荡离心后弃上清，重复此步，直至上清无色且和沉淀物有明显的分界线；所述专用漂洗液主要包括如下有效组分：2％～4％PVP，1％～2％L-AscorbicAcid，2％～4％Triton-X100，4％～5％β-mercatoeyhanol；(3)加入预热的CTAB提取液，60℃～65℃水浴40～60分钟，每5～10分钟颠倒混匀一次；(4)室温放置冷却2～3分钟后加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡，离心；(5)取上清，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，震荡，离心；(6)取上清，加入1/10～1/5体积的3M～4M醋酸钠、双倍以上体积的-20℃预冷的异丙醇，-20℃静置30～50min，4℃离心；(7)去上清，用预冷的75％～80％酒精洗涤沉淀，无水乙醇加速脱水，管口倒置后，晾干，加入TE缓冲液溶解，即得植物基因组DNA；(8)取植物基因组DNA，通过硅胶粉吸附方法纯化，即得纯化后的植物总DNA。2.根据权利要求1所述的壳斗科植物样品DNA的提取和纯化方法，其特征在于，所述硅胶粉吸附方法纯化的步骤如下：(1)称取硅胶粉，加入超纯水震荡混匀，静置，离心30s～1min后除去上清液，重复此步骤多次；(2)在洗过多次的硅胶粉中加入超纯水，配成硅胶悬浊液并混匀，分装至各管；(3)取1管硅胶悬浊液，加入1ml～2ml超纯水，震荡混匀，离心20s～30s，弃上清；(4)往硅胶悬浊液中加入5M～6M碘化钾，使溶液中的碘化钾最终浓度为4mol/L，配成硅胶吸附液，震荡混匀，加入DNA，室温置于小型摇床上混匀10～15min，离心3～5min；(5)弃上清，加入硅胶漂洗缓冲液，震荡混匀，离心3～5min，重复此步骤3次；(6)沉淀用无水乙醇漂洗，将沉淀晾干，加入TE缓冲液，37℃温育10～15min后离心3～5min，将上清转移至新的离心管中；(7)在离心管中加入3M～4M乙酸钠，多倍体积的无水乙醇，混匀，置于-20℃静置后，4℃离心；(8)去上清，得到的沉淀用-20℃预冷的75％～80％酒精清洗3～5次，最后用无水乙醇加速脱水，晾干，加入TE缓冲液进行溶解，即得到纯化后的总DNA。3.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑斯斯，李颖，李谦盛，邓敏，黄清俊，
申请(专利权)人：上海应用技术大学，
类型：发明
国别省市：上海,31