一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法技术

本发明专利技术涉及一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法。本发明专利技术从药用植物丹参中克隆得到一条SmMYB2转录因子，通过构建植物过表达及抑制表达载体，遗传转化丹参叶片外植体，获得转基因毛状根；利用QRT‑PCR分析转基因株系中丹酚酸、丹参酮及花青素合成途径中关键酶基因的表达；运用高效液相色谱法分析转基因株系中丹酚酸及丹参酮的含量；利用分光光度计测定转基因植株中花青素的含量。与现有技术相比，本发明专利技术解析了SmMYB2调控丹酚酸及花青素生物合成的机制，提供了一种提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，为生产具有重要临床需求的丹酚酸提供了一种新型优质原料，也为提高花青素等其他物质提供了一种新的思路。

A Method of Transforming SmMYB2 Gene to Increase Salvianolic Acid and Anthocyanin Content in Salvia Miltiorrhiza

The invention relates to a method for transfecting SmMYB2 gene and simultaneously improving salvianolic acid and anthocyanin content in Salvia miltiorrhiza. The invention clones a SmMYB2 transcription factor from the medicinal plant Salvia miltiorrhiza, transforms the leaf explant of Salvia miltiorrhiza by constructing plant over-expression and inhibition expression vector, and obtains the transgenic hairy root; uses QRT-PCR to analyze the expression of key enzymes genes in salvianolic acid, tanshinone and anthocyanin synthesis pathway of the transgenic strain; and uses high performance liquid chromatography to analyze the expression of key enzymes in the transgenic strain. The contents of salvianolic acid and Tanshinone in transgenic plants were determined by spectrophotometer. Compared with the existing technology, the invention has analyzed the mechanism of SmMYB2 regulating salvianolic acid and anthocyanin biosynthesis, provided a method for improving salvianolic acid and anthocyanin content in Salvia miltiorrhiza, provided a new high-quality raw material for the production of salvianolic acid with important clinical needs, and provided a new idea for improving anthocyanin and other substances.

【技术实现步骤摘要】
一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法
本专利技术属于基因工程
，涉及一种转SmMYB2基因提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法。
技术介绍
MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在其N端都含有保守的MYB结构域。MYB结构域是由1-4个大约52个氨基酸(aminoacid，X)的不完全重复序列(MYBrepeats，R)构成，每个重复序列包含3个α-螺旋(helix，H)，其中第2个和第3个螺旋形成1个螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)的结构，含有3个保守的色氨酸(tryptophan，W)残基。根据MYB结构域R个数的不同，MYB可以分为四类：(1)只含有一个R(R1/2)蛋白；(2)含有2个重复R的R2R3-MYB蛋白；(3)含有3个R的R1R2R3-MYB蛋白；(4)含有4个R的MYB蛋白。植物中最多的MYB转录因子为R2R3-MYB转录因子，可调控初级和次级代谢、参与环境胁迫反应、调控植物的生长和发育。在拟南芥中，bHLH转录因子GLABRA3(GL3)，WD40蛋白TRANSPARENTTESTA8(TT8)和R2R3-MYB转录因子PAP1能够形成MBW复合物参与JA信号通路调控来花青素的生物合成过程。当外界环境中没有JA或其浓度很低时，JAZ与MBW复合物结合，从而抑制激活下游花青素合成相关基因的表达。当外界JA的浓度升高时，JA-Ile促进了SCFCOI1与JAZ的结合，26S蛋白水解酶将JAZ降解掉，释放出MBW复合物，从而激活下游花青素合成相关基因的表达。丹参(Salviamiltiorrhiza)为唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属多年生草本植物，其根色红形状似参而得名“丹参”，以干燥根或根茎入药，被广泛地应用于治疗心、脑血管疾病。丹参中有效活性成分主要分为两大类，一类为水溶性的酚酸类化合物，具有抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化、改善记忆功能障碍等药理作用，主要包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、咖啡酸、迷迭香素、丹参素等；另一类为脂溶性的丹参酮类化合物，主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢丹参酮等，在抗氧化、消炎抑菌及抗肿瘤等方面具有显著疗效。已有研究报道R2R3-MYB转录因子在植物次生代谢调控过程中发挥重要作用。例如过表达拟南芥的AtMYB75能够明显提高丹参转基因植株中丹酚酸B的含量。因此挖掘丹参自身的R2R3-MYB转录因子来提高丹酚酸或黄酮类物质的含量并解析其作用机制具有重大的意义。利用基因工程手段深入研究SmMYB2对丹酚酸、花青素生物合成的调控机理，为深入了解丹参中次级代谢产物的生物合成机制奠定了基础，也为提高次级代谢产物的含量提供一种新功能基因和调控策略。
技术实现思路
本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的不足而提供一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，并解析了其生物调控机制。本专利技术可以通过以下技术方案来实现：本专利技术从丹参中克隆得到SmMYB2转录因子，其基因编码框序列为795bp；QRT-PCR分析其组织表达谱及诱导表达谱；构建亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，激光共聚焦显微镜观察SmMYB2基因在细胞中的定位；构建过表达及抑制载体，遗传转化丹参叶片获得转基因毛状根；QRT-PCR分析SmMYB2及丹酚酸、花青素生物合成相关基因在毛状根中的表达；高效液相色谱测定转基因毛状根中丹酚酸及丹参酮的含量；利用分光光度计检测转基因植株中花青素的含量；利用双荧光素报告基因检测实验(Dual-LUC)及凝胶迁移实验(EMSA)验证其调控丹酚酸合成的关键靶基因；利用双分子荧光互补实验(BiFC)确定与SmMYB2发生相互作用的蛋白。具体而言，本专利技术的内容包括：一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，包括以下步骤：(1)采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB2基因，所述SmMYB2基因序列为SEQIDNO.1所示的DNA序列；其对应的氨基酸序列如SEQIDNO.52所示。(2)根据丹参SmMYB2基因序列，设计定量PCR引物，QRT-PCR分析SmMYB2在丹参的不同组织中的表达模式；(3)根据丹参SmMYB2基因序列，设计定量PCR引物，QRT-PCR分析SmMYB2对不同诱导子调控的响应模式；(4)构建SmMYB2的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，对SmMYB2进行亚细胞定位分析；(5)把SmMYB2基因可操作性地构建于表达调控序列，形成含SmMYB2基因的植物过表达与抑制表达载体，即构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX；(6)将步骤(5)所得的植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；(7)利用步骤(6)所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；(8)QRT-PCR检测步骤(7)获得的丹参转基因毛状根中SmMYB2基因及丹酚酸、丹参酮、花青素生物合成途径中关键酶基因的表达；(9)高效液相色谱法测定步骤(7)中转基因毛状根中丹酚酸及丹参酮的含量；(10)分光光度计测定步骤(7)中转基因毛状根中花青素的含量；(11)双荧光素报告实验(Dual-LUC)检测SmMYB2对丹酚酸生物合成关键酶基因启动子的激活；(12)凝胶迁移实验(EMSA)证明SmMYB2与SmCYP98A14的作用；(13)双分子荧光互补实验(BiFC)体内验证SmMYB2与SmbHLH1的相互作用。本专利技术一个实施方式中，步骤(3)所述不同诱导子包括酵母提取物(YE)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、甲基茉莉酸(MeJA)、赤霉素(GA3)、乙烯(ethylene)等。本专利技术一个实施方式中，步骤(4)构建SmMYB2的亚细胞定位载体，瞬时转化烟草叶片，对SmMYB2进行亚细胞定位分析的具体方法为：4.1.将含有SmMYB2基因的亚细胞定位载体转化根瘤农杆菌；4.2.用无菌注射器吸取农杆菌菌液注射生长良好的烟草叶片；4.3.光照培养40-48小时，取叶片于载玻片上，背面朝上，用双蒸水浸润，用盖玻片固定叶片，避免产生气泡，于激光共聚焦显微镜下观察。本专利技术一个实施方式中，所述载体为pMON530，根瘤农杆菌为菌株ASE。本专利技术一个实施方式中，步骤(5)构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2所使用的植物表达载体为经过改造获得的pCAMBIA2300+载体，包含CaMV35S启动子和NOS终止子、多克隆位点、复制起始点及卡那霉素抗性位点。本专利技术一个实施方式中，步骤(6)所述发根农杆菌为C58C1菌株。本专利技术一个实施方式中，步骤(7)所述PCR检测方法如下：7.1.设计发根位点基因rolB的特异引物，进行PCR扩增；7.2.设计插入基因SmMYB2及NOS终止子上、下游特异性引物，进行DNA扩增；7.3.琼脂糖凝胶电泳检测，出现目的条带则为阳性克隆。本专利技术一个实施方式中，步骤(8)所述QRT-PCR检测方法如下：8.1.对PCR鉴定为阳性的克隆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，在丹参中过表达SmMYB2。

【技术特征摘要】
1.一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，在丹参中过表达SmMYB2。2.根据权利要求1所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用基因克隆的方法从丹参中克隆获得SmMYB2基因；构建SmMYB2的亚细胞定位载体；构建植物过表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及抑制表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX；将所得的植物表达载体pCAMBIA2300+-SmMYB2及pCAMBIA2300+-SmMYB2-SRDX转化发根农杆菌，获得用于转化丹参的发根农杆菌菌株；利用所构建的发根农杆菌菌株遗传转化丹参外植体，获得经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆；经PCR检测为阳性的转基因毛状根克隆中，转SmMYB2基因提高丹参中丹酚酸及花青素含量。3.根据权利要求1或2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，所述SmMYB2基因序列为SEQIDNO.1所示的DNA序列。4.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，构建SmMYB2的亚细胞定位载体所用载体为pMON530。5.根据权利要求2所述一种转SmMYB2基因同时提高丹参中丹酚酸及花青素含量的方法，其特征在于，构...

【专利技术属性】
技术研发人员：开国银，周伟，黄芬芬，陆孙杰，时敏，邓昌平，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，上海师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33