水稻基因OsZIP4的基因工程应用制造技术

本发明专利技术公开了水稻基因OsZIP4的基因工程应用，所述的水稻基因OsZIP4在Genbank的登录号为Os08g10630，具体为水稻基因OsZIP4在调节水稻锌分配中的应用和在调节水稻分蘖生长中的应用。基因OsZIP4在水稻锌转运分配及分蘖生长中起到重要作用，研究发现水稻过量表达基因OsZIP4或其同源基因可以显著提高水稻早发分蘖、提前抽穗提前开花、提高有效分蘖数量、达到理想株型；缩短生长周期；以达到提高产量；优质高效利用养分；对提高大米营养品质具有重要的应用价值。

Application of Rice Gene OsZIP4 in Gene Engineering

The invention discloses the genetic engineering application of rice gene OsZIP4. The registration number of the rice gene OsZIP4 in Genbank is Os08g10630, specifically the application of rice gene OsZIP4 in regulating zinc distribution of rice and in regulating tillering growth of rice. OsZIP4 gene plays an important role in zinc transport, distribution and tillering growth of rice. It was found that overexpression of OsZIP4 or its homologous genes in rice can significantly improve early tillering, early heading and flowering, increase effective tiller number and reach ideal plant type, shorten growth cycle, increase yield, utilize nutrients with high quality and efficiency, and improve nutritional quality of rice. It has important application value.

【技术实现步骤摘要】
水稻基因OsZIP4的基因工程应用
本专利技术涉及水稻锌分配基因的基因工程应用，具体涉及水稻基因OsZIP4的基因工程应用。
技术介绍
水稻(Oryzasativa)是世界上最重要的粮食作物之一，为全球21％的人口提供食物热量，甚至在亚洲地区76％的热量来源于水稻(Fitzgerald,Melissa,A.,McCouch,Susan,R.,Hall,&Robert,D.(2009).Notjustagrainofrice:thequestforquality.TrendsinPlantSci,14(3),133-139.)。锌(Zn)是植物生长和发育的必需微量元素。它涉及不同的生化过程如蛋白质合成，碳水化合物代谢，RNA和DNA的合成与分解等。锌(Zn)也是生长素合成所需元素，因此缺锌导致发育不良和“小叶病”(Broadley,M.,Brown,P.,Cakmak,I.,Rengel,Z.andZhao,F.(2011)Functionofnutrients:micronutrients.InMarschner’sMineralNutritionofHigherPlants(Marschner,P.,ed).SanDiego:AcademicPress,pp.212–223.)。水稻分蘖是植物株型和产量的主要决定因素，一般受激素、营养、环境综合调控(Ruyter-Spira,C.,Al-Babili,S.,vanderKrol,S.&Bouwmeester,H.Thebiologyofstrigolactones.TrendsPlantSci.18,72–83(2013).)。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供了水稻基因OsZIP4的基因工程应用，通过过表达基因OsZIP4控制水稻锌转运分配及促进分蘖生长。技术方案：本专利技术所述水稻基因OsZIP4的基因工程应用，所述的水稻基因OsZIP4在Genbank的登录号为Os08g10630，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。优选地，水稻基因OsZIP4在调节水稻锌分配中的应用；更优选地，水稻基因OsZIP4在调节锌通过节往地上部分分配中的应用，主要体现在从基部节(根茎结合部)往顶端分生组织和侧生分生组织的转运。优选地，水稻基因OsZIP4在调节水稻分蘖生长中的应用；更优选地，水稻基因OsZIP4在调节水稻提前分蘖、提高有效分蘖数、缩短生长周期和/或提高产量中的应用。优选地，水稻基因OsZIP4在转基因水稻或转基因水稻种子中的应用。其中，水稻OsZIP4基因属于水稻锌铁转运家族，在水稻基部节及各个节中高度表达。在分蘖期，分蘖芽中OsZIP4蛋白表达量极高，该基因的T-DNA插入突变体锌显著在基部节中积累，分蘖芽生长延迟。采用反向遗传学方法，利用T-DNA插入水稻突变体及回补实验，通过检测表明该基因在水稻节部对锌具有分配作用，主要体现在从基部节往顶端分生组织和侧生分生组织的转运。通过基因工程技术适当提高OsZIP4基因的表达量能够促进水稻早发分蘖，表明可以使用基因工程技术调节水稻分蘖性状。水稻基因OsZIP4的基因工程应用的基因工程应用，包括以下步骤：(1)总RNA的提取水稻在1/2强度的KimuraB营养液中培养，称取适量的根，用液氮充分研磨，使用植物RNA提取试剂盒提取根中的总RNA；(2)基因OsZIP4的CDS片段的克隆以步骤(1)得到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒对RNA样品进行反转录合成cDNA；利用NCBI网站的基因数据库检索到水稻基因OsZIP4的核苷酸序列，利用基因OsZIP4的CDS序列设计引物，其中上游引物的5’端添加attB1位点序列，下游引物5’端添加attB2位点序列，OsZIP4-F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGACGCCATGAGGCAGAGCACGC-3’；OsZIP4-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCGTGCTCTGCCTCATGGCGTCCAT-3’；以cDNA为模板，以OsZIP4-F/OsZIP4-R为引物，利用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：(1)94℃预变性2min；(2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；(3)72℃5min；扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收，得到基因OsZIP4的CDS片段；(3)超表达载体pGWB2-OsZIP4的构建将步骤(2)得到的基因OsZIP4的CDS片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221上，然后通过LR反应将基因OsZIP4的CDS片段连接到植物表达载体pGWB2上，得到超表达载体pGWB2-OsZIP4，将超表达载体pGWB2-OsZIP4转化至感受态大肠杆菌DH5α中，然后进行菌落PCR鉴定，扩增阳性菌落并提取超表达载体pGWB2-OsZIP4备用；(4)转基因植株的获得将步骤(3)获得的超表达载体pGWB2-OsZIP4转化到农杆菌再侵染至水稻的愈伤组织中，共培养，经过清洗、选择培养、分化、生根、炼苗得到T0代转基因植株；对所有的转基因材料进行两次扩繁，得到稳定遗传的T1代和T2代材料。优选地，步骤(4)中所述超表达载体pGWB2-OsZIP4的转化方法为农杆菌介导法。优选地，植物表达载体可用任何一种启动子例如35S启动子、Ubiquitin启动子或其他启动子，该表达载体必要时可使用包括增强子，不论是转录增强子或者翻译增强子；为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可以利用颜色变化或发光来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。更优选地，本专利中的植物表达载体为pGWB2，包括35S启动子、潮霉素抗性。有益效果：(1)qRT-PCR分析水稻基因OsZIP4在水稻节中高度表达，并且受缺锌诱导；申请人首次公开了水稻OsZIP4蛋白在节部韧皮部及维管束薄壁细胞区域高度表达；分蘖期时在分蘖芽中OsZIP4蛋白表达量高于节部数倍。(2)日本晴野生型(WT-1)、突变体株系1(oszip4-1)、中花11野生型(WT-2)、突变体株系2(oszip4-2)，回补株系(Comp-1；Comp-2)在正常生长条件下，发现基因突变导致锌元素在基部节中积累，分蘖芽生长迟缓，锌元素在分生组织中含量降低，且在分蘖期导致分蘖生长延缓。(3)基因OsZIP4在水稻锌转运分配及分蘖生长中起到重要作用，研究发现水稻过量表达基因OsZIP4或其同源基因可以显著提高水稻早发分蘖、提前抽穗提前开花、提高有效分蘖数量、达到理想株型、缩短生长周期；对提高产量、优质高效利用养分、提高大米营养品质具有重要的应用价值。附图说明图1为日本晴野生型水稻在不同时期、不同部位的基因OsZIP4表达量；图2为WT-1根系中基因OsZIP4对缺锌(0)、过量锌(4μM)、缺铁(0)、缺锰(0)、缺铜(0)的响应；图3为水稻基因OsZIP4在基部节横切面韧皮部的表达；图4为水稻基因OsZIP4在水稻分蘖芽纵切面的表达；图5为水稻基因OsZIP4在水稻分蘖芽横切面的表达；图6为日本晴野生型(WT-1)、突变体株系1(oszi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻基因OsZIP4的基因工程应用，所述的水稻基因OsZIP4在Genbank的登录号为Os08g10630。

【技术特征摘要】
1.水稻基因OsZIP4的基因工程应用，所述的水稻基因OsZIP4在Genbank的登录号为Os08g10630。2.根据权利要求1所述的基因工程应用，其特征在于，所述水稻基因OsZIP4在调节水稻锌分配中的应用。3.根据权利要求2所述的基因工程应用，其特征在于，所述水稻基因OsZIP4在调节锌通过节往地上部分分配中的应用。4.根据权利要求1所述的基因工程应用，其特征在于，所述水稻基因OsZIP4在调节水稻分蘖生长中的应用。5.根据权利要求4所述的基因工程应用，其特征在于，所述水稻基因OsZIP4在调节水稻提前分蘖、提高有效分蘖数、缩短生长周期和/或提高产量中的应用。6.根据权利要求1-5任意一项所述的基因工程应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)总RNA的提取水稻在1/2强度的KimuraB营养液中培养，称取适量的根，用液氮充分研磨，使用植物RNA提取试剂盒提取根中的总RNA；(2)基因OsZIP4的CDS片段的克隆以步骤(1)得到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒对RNA样品进行反转录合成cDNA；利用NCBI网站的基因数据库检索到水稻基因OsZIP4的核苷酸序列，利用基因OsZIP4的CDS序列设计引物，其中上游引物的5’端添加attB1位点序列，下游引物5’端添加attB2位点序列，OsZIP4-F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGACGCCATGAGGCAGAGCACGC-3’；...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑录庆，牟帅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32