百合叶肉原生质体的制备方法技术

本发明专利技术公开了百合叶肉原生质体的制备方法，包括步骤：(1)取带有未开放花蕾的百合植株，进行暗处理；(2)取植株的叶片，清洗、消毒；(3)向叶肉材料中加入酶解溶液，于暗处真空抽提，然后暗处静置酶解数小时，得到含有叶肉原生质体的酶解液；(4)所得酶解液用W5溶液稀释，网筛过滤，所得滤液经低速离心，弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，弃上清，重复洗一次；用MMG溶液重悬原生质体沉淀。本发明专利技术克服了百合叶肉原生质体分离效率低的问题，有效建立了百合叶肉原生质体制备的方法。

Preparation of Lily Mesophyll Protoplasts

The invention discloses a preparation method of Lily mesophyll protoplast, which comprises the following steps: (1) taking lily plants with unopened buds for dark treatment; (2) taking leaves of lily plants for cleaning and disinfection; (3) adding enzymatic solution to mesophyll materials, extracting them in a vacuum in the dark, and then standing in the dark for several hours to obtain enzymatic hydrolysate containing mesophyll protoplasts; (4) using W as the enzymatic hydrolysate. 5. The filtrate was diluted by solution and filtered by screen. The filtrate was centrifuged at low speed, discarded supernatant, suspended protoplast precipitation with W5 solution, centrifuged at low speed, discarded supernatant, washed repeatedly, and suspended protoplast precipitation with MMG solution. The invention overcomes the problem of low separation efficiency of Lily mesophyll protoplasts, and effectively establishes a method for preparing lily mesophyll protoplasts.

【技术实现步骤摘要】
百合叶肉原生质体的制备方法
本专利技术涉及植物原生质体制备技术，具体地说，涉及百合叶肉原生质体的制备方法。
技术介绍
原生质体指的是去除细胞壁的由质膜包被的裸露细胞。原生质体具有细胞全能性，可再生成完整的植株。原生质体可摄入外源基因、病毒、质粒等物质，是植物细胞工程进行一系列操作、基因转化的优良材料。此外，通过原生质体融合技术，还可改变遗传物质，获得新品种。因此原生质体分离和再生在植物遗传育种、性状改良和遗传转化等领域都具有重要的意义。百合(Liliumspp.)为百合科百合属的多年生球根花卉，是世界著名的观赏花卉。随着市场的扩大，人们对于新品种百合的需求与日俱增，百合的遗传性状改良成为其产业发展的重要内容。此外，百合的分子生物学发展日趋深入，但由于百合的遗传转化体系较难建立，基因功能研究明显滞后，因此瞬时表达体系对百合基因功能的研究具有重要意义。而原生质体分离正是遗传性状改良和瞬时表达中的一项基本技术。百合作为高度杂合的单子叶植物，原生质体分离培养的难度较大，目前国内外有关百合原生质体制备的研究报道较少。Horita(HoritaM，MorohashiH，KomaiF.Regene本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.百合叶肉原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对百合植株进行暗处理；(2)取步骤(1)经暗处理后植株叶片，进行清洗、消毒；(3)向消毒后叶片材料中加入酶解溶液，于暗处真空抽提，然后于暗处静置酶解数小时，得到含有叶肉原生质体的酶解液；(4)步骤(3)所得酶解液用W5溶液稀释，然后用网筛过滤，所得滤液经低速离心，弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，弃上清，再用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，用MMG溶液重悬原生质体沉淀；其中，步骤(3)中酶解溶液的活性成分为纤维素酶和离析酶。

【技术特征摘要】
1.百合叶肉原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对百合植株进行暗处理；(2)取步骤(1)经暗处理后植株叶片，进行清洗、消毒；(3)向消毒后叶片材料中加入酶解溶液，于暗处真空抽提，然后于暗处静置酶解数小时，得到含有叶肉原生质体的酶解液；(4)步骤(3)所得酶解液用W5溶液稀释，然后用网筛过滤，所得滤液经低速离心，弃上清，用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，弃上清，再用W5溶液重悬原生质体沉淀，低速离心，用MMG溶液重悬原生质体沉淀；其中，步骤(3)中酶解溶液的活性成分为纤维素酶和离析酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中黑暗处理24～72h，优选48h。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所取叶片为植株顶端、中部和下部叶片，优选顶端叶片。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中叶片消毒的具体方法为：用肥皂水浸泡后流水冲洗，然后用70～75％酒精浸泡5min，无菌水冲洗干净，吸干水分。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中酶解溶液的配方为：1～2％纤维素酶R-10、0.2～1％离析酶R-10、10-20mmol/L氯化钾、10-20mmol/L2-(N-吗啉代)乙烷磺酸、10-15mmol/L氯化钙、0.4-0.6mol/L甘露醇和0.1％牛血清蛋白，pH5.7-5.8。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中叶肉酶解时间为4～10h，优选7h。7.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙明，石雪珺，张启翔，张腾旬，钟剑，陈俊通，程堂仁，潘会堂，王佳，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11