一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法技术

本发明专利技术属于蛋白质组学技术领域，具体首次公开了一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法，包括水稻叶片粗质膜的提取、水稻叶片质膜的纯化及水稻叶片质膜磷酸化蛋白质的富集等步骤。本发明专利技术所述提取方法操作简单、提取效率高、成本低，所获的水稻叶片质膜纯度可达93%以上，从质膜蛋白质中富集的质膜磷酸化蛋白质得率为3.33～3.89%。该方法适合于质膜磷酸化蛋白提取困难、干扰杂质多的植物材料；同时所得质膜磷酸化蛋白杂质和干扰物较少，可满足双向电泳的要求，所获双向电泳图谱背景清晰、蛋白质点分布均匀、纵向拖尾和水平横纹现象较少，且具有良好的重复性；该方法适用于单子叶植物质膜磷酸化蛋白质组的制备与分析。

A Method for Extracting Phosphorylated Protein from Rice Leaves by Two-dimensional Electrophoresis

The invention belongs to the technical field of proteomics, and specifically discloses for the first time a method for extracting plasma membrane phosphorylated protein of rice leaves suitable for two-dimensional electrophoresis, including the steps of extracting rough plasma membrane of rice leaves, purifying plasma membrane of rice leaves and enriching plasma membrane phosphorylated protein of rice leaves. The extraction method has the advantages of simple operation, high extraction efficiency and low cost. The purity of plasma membrane of rice leaves can reach over 93%, and the yield of phosphorylated protein enriched from plasma membrane protein is 3.33-3.89%. This method is suitable for plant materials with difficult extraction of plasma membrane phosphorylated proteins and more interference impurities. At the same time, the obtained plasma membrane phosphorylated proteins have fewer impurities and interference substances, which can meet the requirements of two-dimensional electrophoresis. The obtained two-dimensional electrophoresis patterns have clear background, uniform distribution of protein spots, fewer longitudinal tail and horizontal cross-lines, and have good repeatability. Preparation and analysis of phosphorylated proteome of material membrane.

【技术实现步骤摘要】
一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法
本专利技术涉及蛋白质组学
，具体地，涉及一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法。
技术介绍
蛋白质磷酸化是指蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。作为蛋白质翻译后修饰的最重要形式之一，蛋白质磷酸化调节着细胞内几乎所有的生命活动，尤其在调节细胞信号传导过程中起着极其重要的作用。磷酸化蛋白质组学是指采用蛋白质组学的分析方法，从整体上观察细胞中磷酸化蛋白质的修饰状态及其变化，进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制；其内容主要包括磷酸化蛋白质的富集、检测、鉴定和定量等。其中，双向电泳(2-dementionalgelelectrophoresis,2-DE)技术仍是目前磷酸化蛋白质组学研究中最成熟最经典的蛋白分离技术，其研究策略是先对磷酸化蛋白质进行纯化和富集，再通过电泳技术等对磷酸化蛋白进行分离。2-DE技术具有高通量、高分辨率和良好的重复性等优点，可以清楚反映蛋白质点的分子量和等电点信息，是植物磷酸化蛋白质组学研究中最常采用的方法之一。植物细胞质膜上存在识别外界各种胁迫信号和参与信本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种水稻叶片粗质膜的提取缓冲液，其特征在于，包含以下组分：终浓度50 mmol/L的BTP‑MES缓冲液，终浓度250～500 mmol/L的蔗糖，终浓度0.5～10 mmol/L的EDTA，10～20% v/v甘油，0.1～1% w/v BSA，终浓度1～10 mmol/L的PMSF，终浓度0.1～2 mmol/L的DTT，0.6～5% w/v PVP k‑30，终浓度10～50 mmol/L的NaF，终浓度5～15 mmol/L的β‑巯基乙醇，终浓度1～2 mmol/L的NaMoO4·2H2O，终浓度0.05～2 mmol/L的NaVO3，终浓度2.5～10 mmol/L的焦磷酸钠，...

【技术特征摘要】
1.一种水稻叶片粗质膜的提取缓冲液，其特征在于，包含以下组分：终浓度50mmol/L的BTP-MES缓冲液，终浓度250～500mmol/L的蔗糖，终浓度0.5～10mmol/L的EDTA，10～20%v/v甘油，0.1～1%w/vBSA，终浓度1～10mmol/L的PMSF，终浓度0.1～2mmol/L的DTT，0.6～5%w/vPVPk-30，终浓度10～50mmol/L的NaF，终浓度5～15mmol/L的β-巯基乙醇，终浓度1～2mmol/L的NaMoO4·2H2O，终浓度0.05～2mmol/L的NaVO3，终浓度2.5～10mmol/L的焦磷酸钠，0.01～0.02%w/vBrij56；所述水稻叶片粗质膜提取缓冲液的pH值为7.6～7.8。2.根据权利要求1所述的提取缓冲液，其特征在于，所述提取缓冲液包括以下组分：终浓度50mmol/L的BTP-MES缓冲液，终浓度250mmol/L的蔗糖，终浓度2mmol/L的EDTA，10%v/v甘油，0.5%w/vBSA，终浓度10mmol/L的PMSF，终浓度2mmol/L的DTT，0.6%w/vPVPk-30，终浓度40mmol/L的NaF，终浓度15mmol/L的β-巯基乙醇，终浓度1mmol/L的NaMoO4·2H2O，终浓度1mmol/L的NaVO3，终浓度10mmol/L的焦磷酸钠，0.02%w/vBrij56，pH值为7.8。3.一种用于水稻叶片质膜磷酸化蛋白富集的缓冲液，其特征在于，包含以下组分：终浓度20～50mmol/L的MES，终浓度10～40mmol/L的咪唑，终浓度7～8mol/L的尿素，终浓度0.1～0.2mol/L的天冬氨酸钾，终浓度0.1～0.2mol/L的谷氨酸钠，0.2～4%w/vCHAPS，pH值为6.0～6.3。4.根据权利要求3所述的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液包含以下组分：终浓度30mmol/L的MES，终浓度30mmol/L的咪唑，终浓度8mol/L的尿素，终浓度0.1～0.15mol/L的天冬氨酸钾，终浓度0.1～0.15mol/L的谷氨酸钠，0.25%w/vCHAPS，pH值为6.1。5.一种适于双向电泳的水稻叶片质膜磷酸化蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.水稻叶片粗质膜的提取：将水稻叶片研磨成粉末，按质量体积比为4:13加入权利要求1或2任一所述的提取缓冲液，研磨至匀浆；过滤、于11500×g离心20min，然后取上清液于87000×g离心40min后，再将沉淀悬浮于相缓冲液中，即得粗质膜溶液；S2.水稻叶片质膜的纯化：将S1所得粗...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂燕芳，李云锋，王振中，叶智坚，邹小桃，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44