一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法技术

本发明专利技术公开了一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法，首先使用组合酶将马尾松嫩茎酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。本发明专利技术构建得到马尾松原生质体瞬时表达系统，易于操作和实现，该方法的转化效率可达50％。本发明专利技术适用于马尾松实生苗，利用嫩茎可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达80％以上，对于野外的成熟茎段组织也适用，为马尾松功能基因研究提供了快速便捷的研究平台。

【技术实现步骤摘要】
一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体地说，本专利技术涉及一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法。
技术介绍
马尾松(Pinusmassonianalamb.)，松科(Pinaceae)松属(Pinus)双维管亚属(Subgen.Pinus)油松组(Sect.Pinus)常绿大乔木，原产于台湾，广泛分布于中国中部及以南(包括香港)和越南北部南方等亚热带地区。马尾松不仅是南方重要的材用树种，还是荒山恢复森林的先锋树种，在造林绿化、花粉和次生产物的利用上也有着广泛的应用，具有较高的经济价值和生态价值。原生质体是进行遗传转化的理想受体，也是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，在细胞工程学、育种学、生物工程学等研究领域都得到了应用。目前，植物原生质体被广泛应用于研究瞬时表达、启动子分析、种质资源改良等领域。近年来，利用原生质体进行亚细胞定位、蛋白互作以及基因沉默与表达等研究在水稻和玉米等模式物种中常有报道。在原生质体瞬时表达系统具有检测快速、通量高等特点，结合报告基因的使用，该技术已被广泛用于目标基因表达、蛋白亚细胞定位、启动子本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法，其特征在于，首先使用组合酶将马尾松嫩茎酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。

【技术特征摘要】
1.一种马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法，其特征在于，首先使用组合酶将马尾松嫩茎酶解成原生质体，得到的原生质体经分离、纯化和预处理后，利用PEG法将携带GFP标签的空载体转入马尾松原生质体中，经过培养，使得空载体在原生质体中表达。2.根据权利要求1所述的马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法，其特征在于，组合酶含有1-3％vol纤维素酶和0.1-0.5％vol果胶酶。3.根据权利要求1或2所述的马尾松嫩茎原生质体分离纯化及瞬时高效转化方法，其特征在于，包括如下步骤：1)取5-25天马尾松实生苗嫩茎，切成细条状备用；2)5mL组合酶液体系的配制：0.6M甘露醇、20mMMES、50mMKCl、组合酶，10mMCaCl2和0.1wt％BSA；0.45μm滤膜过滤灭菌；3)将步骤1)切成细条状的嫩茎放入步骤2)制得的酶液中浸透，28℃静置4-6h；4)在步骤3)的反应液中加入与酶液等体积的W5溶液，于冰上通过200目细胞筛过滤至50mL圆底管中；900rpm，4℃离心5min，吸出上清，再加入1-2mLW5溶液，轻柔摇匀，并用血球计数板计数；置于冰上黑暗静置15min，使原生质体沉于管底吸出上清，并加入一定体积的MMG或WI将原生质体溶液的细胞浓度稀释成104-106个/mL，并重悬；5)在EP管中加入5-25μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥猛，徐梦璇，冯源恒，徐立安，杨章旗，
申请(专利权)人：南京林业大学，广西壮族自治区林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：江苏,32