用于干细胞的培养基制造技术

用于扩增和分化干细胞群以及用于获得类器官的培养基和方法。通过本发明专利技术的方法而获得的扩增细胞群和类器官及其在药物筛选、毒性测试和再生医疗中的用途。

Medium for Stem Cells

Medium and method for amplifying and differentiating stem cell population and for obtaining organ-like organs. The expanded cell population and organoid obtained by the method of the present invention and its application in drug screening, toxicity testing and regenerative medicine.

【技术实现步骤摘要】
用于干细胞的培养基本申请是基于中国专利申请第201280039061.8号的分案申请。本文所引用的所有文献以整体形式并入作为参考。
本专利技术在于干细胞培养基及方法领域，特别是用于扩增干细胞群、例如人上皮干细胞群的培养基及方法的领域。
技术介绍
对用于扩增干细胞群的培养基和方法存在很大的关注。干细胞群具有诸多用途。例如，干细胞及其分化后代可用于细胞测试、药物筛选及毒性测试。干细胞还表现出基于细胞的治疗的前景，例如在用于治疗受损组织的再生医疗方面。它们还用作分化细胞的源以用于移植目的，例如移植用于治疗糖尿病的胰腺β细胞等。此外，高效的细胞培养基对于提供和维持用于研究目的的细胞群而言是重要的。还对用于培养干细胞以形成、维持和扩增类器官、例如肠隐窝绒毛、胃或胰腺类器官的培养基及方法存在关注。类器官包括干细胞，例如上皮干细胞，其保持它们的未分化表型和自我更新性质，但还具有生长成组织样结构的分化后代。类似于相关或相同的细胞的群，隐窝绒毛、胃或胰腺类器官更近地模拟它们的器官组织的基础生理机能，它们可以用于毒性测试、或者用于药物或食品补充剂的测试。它们还可用于培养目前缺少合适的组织培养物或动物模型的病原体。此外，这样的类器官可用于再生医疗，例如用于辐射后和/或术后修复肠上皮、或用于修复经受炎性肠疾病的患者的肠上皮。明确的是，存在着许多用于干细胞及其支化后代的临床和研究应用。对于所有这些应用，可再现干细胞培养方法对于提供足量的合适品质的细胞而言是极为重要的。例如，对于有效药物筛选，必须小心地控制条件，需要用于控制细胞的分化和增殖的精确培养方法以便可产生纯的表型和染色体组型相同的细胞的群。同样地，对于其中可以向患者直接提供培养的细胞的基于细胞的治疗，细胞必须在遗传和表型上合理以当向患者提供时避免不期望的免疫反应或最终细胞类型。尽管已经描述了用于培养包括肠上皮干细胞在内的原代上皮干细胞的多种培养系统(Bjerknes和Cheng,2006.MethodsEnzymol.419:337-83)，但迄今为止，没有确立维持人上皮干细胞的分化潜能及表型和基因组完整性的长期培养系统。国际专利申请WO2010/090513公开了用于培养上皮肝细胞或分离的组织碎块的方法。使该方法优化以通过向培养基添加Wnt-3a来培养人结肠和肠隐窝。这是首次将人肠干细胞培养物培养延长的时段(高达3个月)并且被规定为首个可再现人肠干细胞培养系统。然而，仍亟需改进的干细胞培养基及方法，特别是人干细胞培养基及方法，其改进在培养物中生长的干细胞的增殖速率、存活时间及表型和基因组完整性。专利技术简述本专利技术提供了改进的用于干细胞、特别是人上皮干细胞以及包括所述干细胞的类器官的培养基及方法，其与已知的培养基及方法相比提供了显著的优势。本专利技术还提供了相关的培养基补充剂、组合物及用途。因此，本专利技术提供了用于扩增干细胞群的培养基，其中所述培养基包括至少一种或多种与一种或多种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶靶标结合并降低其活性的抑制剂。其具有以每周约五倍扩增的扩增速率连续生长至少3个月的作用。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶优选选自：TGFβ受体激酶1、ALK4、ALK5、ALK7、p38。令人惊讶地，专利技术人已发现在培养基中包括某些丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂显著改进了培养基在扩增干细胞群方面的性能。干细胞群可以为正常(健康)细胞或病变细胞(例如，癌干细胞)。特别地，p38和ALK的抑制剂表现为在所有受试化合物之中提供最大的改进。这是出乎意外的，因为不存在预测这些特定抑制剂如何运行的已知机制。实际上，被选择进行测试并以类似途径发挥作用的小分子抑制剂之中多种小分子抑制剂对所述方法没有作用。因此，技术人员不能预测这些特定激酶的抑制剂会对培养基具有此种显著改进。当向培养基共同添加两种抑制剂、例如p38抑制剂如SB202190和ALK抑制剂如A83-01时，仍观察到进一步的改进。为达成这种认知，专利技术人研究了已知在某些癌症、例如结肠直肠癌中被破坏的信号转导途径。他们假定这些影响癌症中的最终细胞类型的途径还在决定培养条件中的最终细胞类型方面发挥作用。然而，应强调的是，这种假设完全是新颖的；因为现有技术不能预测这些额外的化合物中任一种对培养基的作用，并且不具体预期这些化合物中任一种实际上可能具有有益作用。在第一种筛选实验中，与标准干细胞培养基组合地测试了一系列维生素、激素和生长因子。胃泌激素和烟酰胺初步被确定为产生显著改进的培养条件。将这些因子并入标准培养条件，进行第二种筛选实验，其中测试与相关信号转导途径相关的小分子抑制剂，所述相关信号转导途径例如ERK、p38、JNK、PTEN、ROCK和Hedgehog。选择这些途径是因为它们已知在某些癌症中被破坏。使用由Wnt-3A(“W”)优化的前述干细胞培养基(包含上皮生长因子(EGF或“E”)、Noggin(“N”)和R-spondin(“R”)，本文还称为“ENR”培养基)(本文称为“WENR”培养基)培养人肠干细胞的先前尝试已使大部分细胞在7天内蜕变，并且非常少的细胞存活超过1个月。这样的尝试已经历了漫长的增殖时间、染色体异常以及从芽殖到囊状结构的形态变化。“囊状”表示类器官几乎为球形的。“芽殖”表示类器官具有从基础结构生长的多个区域。具有芽殖结构并非总是优点，尽管芽殖结构通常具有更大的表面积并且通常更接近地类似于相应的体内结构。专利技术人表明改进的方法使干细胞连续生长至少7个月。新方法还增加了细胞在扩增的群中的增殖速度。这当使细胞生长以用于商业和医疗目的时明显具有大的用途。新方法还增加了细胞在扩增的群中的品质。这是非常有利的，因为干细胞及其分化后代的临床和研究应用需要提供高品质的细胞群的可再现干细胞培养方法。通常，干细胞的体外扩增旨在提供尽可能接近地类似于其体内相对物的细胞群。这种性质本文称为细胞的“基因组和表型完整性”。专利技术人首次发现可以在不损失基因组和表型完整性的情况下于培养物中扩增人上皮干细胞至少7个月(参见实施例1)。在本专利技术的改进的培养条件下，人肠类器官呈现芽殖类器官结构，而非在先前培养条件下所见的囊状结构。在从三个不同供体采集的20个细胞的每一个细胞中，大于3月龄的类器官的中期分裂相一致地显示出46个染色体。此外，微阵列分析显示培养物中的干细胞具有与包括肠干细胞基因的肠隐窝细胞类似的分子标签。专利技术人还例示了由本专利技术的培养基和方法产生的人肠类器官模拟了对外部因子反应的体内最终细胞类型决定。例如，先前已经表明，肠干细胞中的Notch抑制终止了肠上皮增殖并体内诱导杯形细胞增生。专利技术人还能表明，本专利技术的肠类器官当用Notch抑制剂处理时中断增殖并且大部分细胞在3天内转化成杯形细胞。当在培养基中包括TGF-β抑制剂和/或p38抑制剂以扩增来自其他上皮组织、例如胃、胰腺、肝脏和前列腺的干细胞或类器官时，观察到类似的优势(参见实施例)。组织可以为正常(健康)组织或病变组织，例如癌组织或表现出囊性纤维化表型的组织。这些结果表明与先前的方法和培养基相比，由本专利技术的方法和培养基所产生的对干细胞和类器官的基因组和表型完整性的显著改进。因此，本专利技术提供了用于扩增和/或分化成体干细胞群的培养基，其中所述培养基包括：i.Rspondin1-4之一和/或Rspond本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于扩增和/或分化成体干细胞群的培养基，其中所述培养基包括：i.Rspondin 1‑4和/或Rspondin模拟物之一；以及ii.一种或多种直接或间接负调节TGF‑β信号转导的抑制剂。

【技术特征摘要】
2011.06.30 GB 1111244.8;2011.06.10 US 61/520,569;21.用于扩增和/或分化成体干细胞群的培养基，其中所述培养基包括：i.Rspondin1-4和/或Rspondin模拟物之一；以及ii.一种或多种直接或间接负调节TGF-β信号转导的抑制剂。2.组合物，其包含权利要求1所述的培养基以及细胞外基质或3D基质，所述3D基质通过其与细胞膜蛋白如整合素的相互作用而模拟细胞外基质，所述细胞外基质例如含层粘连蛋白的细胞外基质，诸如MatrigelTM(BDBiosciences)。3.气密容器，其包括前述权利要求中任一权利要求所述的培养基或组合物。4.权利要求1所述的培养基用于扩增和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：约翰尼斯·卡洛鲁斯·克莱威尔斯，佐藤·俊朗，梅里特克赛尔·胡克奥尔特加，沃特·理查德·卡特豪斯，
申请(专利权)人：荷兰皇家科学院，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL