一种核苷类抗菌化合物的发酵制备方法技术

本发明专利技术涉及一种具有抗菌活性的核苷类化合物:阿丝苷酸(丝氨酰氨尿嘧啶核苷)的发酵制备方法。采用“诺尔斯氏链霉菌”(Streptomyces noursei)及其遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌LSP‑1”(Streptomyces noursei LSP‑1)，在液体培养基中进行二级发酵培养，并选用合适的补料液进行流加补料发酵培养；该发酵制备工艺，可以获得较高的细胞浓度和产物合成速率，可以获得较好的阿丝苷酸的产量。提取工艺简便，回收率较高。

A Fermentation Method for the Preparation of Nucleoside Antibacterial Compounds

The invention relates to a fermentation preparation method of a nucleoside compound with antimicrobial activity: asidine (serinyl uracil nucleoside). Streptomyces noursei and its genetically modified strain Streptomyces noursei LSP_1 were used for secondary fermentation in liquid medium and fed-batch fermentation was carried out with appropriate supplement liquid. The fermentation process could obtain high cell concentration and high rate of product synthesis. A better yield of aspartate was obtained. The extraction process is simple and the recovery rate is high.

【技术实现步骤摘要】
一种核苷类抗菌化合物的发酵制备方法所属领域本专利技术属于微生物
，具体涉及一种具有抗菌活性的核苷类化合物的发酵制备方法。
技术介绍
微生物的代谢产物是抗生素的主要来源，核苷类抗生素是一类通常由微生物次级代谢产生的，在结构上含有修饰的核苷和核苷酸的分子的总称；放线菌是产生核苷类抗生素最主要的微生物种类之一。自链霉素发现以来，已从放线菌中发现了大量的抗生素。近年来，人们从普通链霉菌、极端环境放线菌、海洋放线菌和稀有放线菌中寻找新抗生素。如，庆大霉素、红霉素、万古霉素、利福平等已成功应用于临床；应用于农作物病虫害防治的抗生素有灭瘟素、抗霉菌素120、武夷菌素等；由放线菌代谢产物开发的嘌呤核苷类抗生素嘌呤霉素、嘧啶核苷类抗生素尼可霉素、宁南霉素、杀稻瘟菌素、米多霉素及谷氏菌素等，具有广泛的生物活性，包括抗细菌，抗真菌，抗线虫，抗肿瘤，抗病毒，免疫刺激和免疫抑制等活性。本实验室在进行微生物产生核苷类代谢产物的研究过程中，发现一株放线菌经发酵产生一种核苷类化合物，该化合物有很好的抗菌生物活性，尤其对植物病原真菌、植物病毒的抑制活性很强，还具有植物免疫刺激作用。我们将该核苷类化合物命名为阿丝苷酸。研究人员经过长期大量的研究工作，完成了该化合物的分离纯化、理化性质研究、结构鉴定；对该放线菌进行了菌种遗传改良，获得了阿丝苷酸高产菌株，并研究获得了高产菌株发酵生产阿丝苷酸的优化发酵工艺条件，从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的：本专利技术的目的之一，是提供一种核苷类化合物，命名为阿丝苷酸；本专利技术的目的之二，是提供一种用于生产阿丝苷酸的新菌株；本专利技术的目的之三，是提供一种“批次液体培养基流加补料发酵工艺”，发酵生产阿丝苷酸；本专利技术的目的之四，是提供用于生产阿丝苷酸的培养基。更具体地说，本专利技术提供一种核苷类化合物(阿丝苷酸)及其发酵制备方法，包含以下步骤：从一株采自四川宜宾地区土壤的放线菌“诺尔斯氏链霉菌”(Streptomycesnoursei)的发酵液中，经分离、鉴定获得一种核苷类化合物(阿丝苷酸)。将能够产生阿丝苷酸的放线菌“诺尔斯氏链霉菌”(Streptomycesnoursei)及其遗传改良菌株，在一级液体培养基(例如,下文所述的培养基A)中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养；第二级液体培养基接种第一级种子液后培养一段合适的时间，开始进行流加补料液(例如，下文所述的补料液C)的补料发酵培养。发酵结束后，从上述发酵培养液中收集阿丝苷酸，并进行分离纯化、结构鉴定。本专利技术的具体实施方案是，采用“诺尔斯氏链霉菌”(Streptomycesnoursei)或其遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌LSP-1”(StreptomycesnourseiLSP-1)，在液体培养基中进行二级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基，例如下文所述的培养基A、B。在第二级发酵中，接种第一级种子液后，在适合的温度下培养一段时间，例如，在26℃—32℃发酵培养10—30小时后，选用合适的补料液,例如下文所述的补料液C，进行流加补料发酵培养。第二级液体培养流加补料(例如补料液C)的方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续流加方式是优选的。所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以一定的流加速率,如0.01—6.0L/h，(匀速或非匀速)将适合的补料液(例如补料液C)连续流加入第二级发酵罐中，直至停止发酵(下罐)前大约5-30小时。所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将适合的补料液(例如补料液C)流加入第二级发酵罐中。间歇时间优选为每1-24小时补料1-12次，优选为间隔1-2小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.01％—2.5％，优选为0.05％—0.5％。本领域技术人员也可以根据需要，采用其他的适合时间间隔补料。发酵条件：温度26℃—32℃，PH：6-8发酵时间：2-4天发酵结束后，将发酵液经微滤去除菌体、不溶性蛋白及其它大分子物质，微滤的操作压力为0.1-0.8Mpa,操作温度为1-50℃，滤出液占进料液体积20％-90％，透析水量占进料液体积的30％-90％，合并滤出液；将微滤滤出液再经纳滤浓缩，所得浓缩液用真空旋转蒸发仪55℃蒸干，获得褐色膏状粗品。粗品经过正相硅胶柱层析，洗脱剂采用氯仿：甲醇：水＝5：5：0.4，洗脱液用管碟法进行活性跟踪检测，收集活性部分；再采用C18反相硅胶柱层析继续分离纯化,用纯水为流动相，进行样品的洗脱，对洗脱液进行活性跟踪检测和收集，得到的活性样品进行高效液相色谱纯化制备(制备条件：色谱柱为SP-120-5-ODS-BIO4.6mmX150mm,流动相为甲醇：水＝3：7,流速：0.8ml/min,进样量10ul，检测器：SPD-10A)，获得一种具有抑菌活性的白色粉末状单一化合物(阿丝苷酸)。通过对该单一化合物的紫外-可见光波段扫描分析、质谱分析、分子量测定、一维和二维核磁共振分析等，获得该单一化合物的化学结构为：1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸，其结构具有典型的核苷类化合物的特性，属于丝氨酰氨尿嘧啶核苷，其分子量为374.1，分子式为：C13H18N4O9，其化学结构为：阿丝苷酸(1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸,)采用本专利技术工艺，在第二级发酵时，通过流加补料液发酵，可以维持较好的碳氮比，提高发酵体系中细胞的浓度，有利于提高溶解氧的利用率，从而提高阿丝苷酸的产量。在优选的具体实施方案中，本专利技术还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高阿丝苷酸的产量。在优选的本专利技术方法中，本专利技术特别提供一株用于生产阿丝苷酸的诺尔斯氏链霉菌遗传改良菌株“诺尔斯氏链霉菌LSP-1”(StreptomycesnourseiLSP-1)；其已于2018年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.15164),地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本专利技术发酵生产所采用的培养基A、B及补料液C的具体组成质量百分比如下：培养基B：成分一般范围优选范围淀粉0.1％-5.0％0.3％-3.0％糊精0.1％-5.0％0.3％-2.0％蔗糖/糖蜜0.1％-4.0％0.3％-3.0％硫酸铵0.01％-2.0％0.1％-2.0％葡萄糖0.1％-10.0％0.5％-6.0％花生粉或花生粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％黄豆粉或黄豆粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％玉米粉0.1％-10.0％0.5％-5.0％酵母粉0.01％-4.0％0.1％-2.0％磷酸氢二钾0.01％-5.0％0.05％-1.0％硫酸镁0.01％-5.0％0.05％-1.0％氯化钠0.01％-5.0％0.05％-1.0％补料液C：成分一般范围优选范围蔗糖/糖蜜0.1％-4.0％0.3％-3.0％葡萄糖0.1％-10.0％0.5％-6.0％黄豆粉或黄豆粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％花生粉或花生粉水解液0.1％-10.0％0.5％-5.0％本专利技术优选实施方案的发酵工艺全过程为:将活化后的诺尔斯氏链霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核苷类抗菌化合物,命名为阿丝苷酸,其化学结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种核苷类抗菌化合物,命名为阿丝苷酸,其化学结构式如下：2.权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物的分子量为374.1，分子式为：C13H18N4O9，化学名称为1-尿嘧啶-4-丝氨酰氨基-1，4-二脱氧-β-D-吡喃葡萄糖醛酸，其结构具有典型的核苷类化合物的特性，属于丝氨酰氨尿嘧啶核苷。3.权利要求1所述的化合物的发酵制备方法，其特征是：采用放线菌诺尔斯氏链霉菌Streptomycesnoursei及其遗传改良菌株，在一级液体培养基A中培养，作为种子液；将培养好的种子液接种到第二级液体培养基B中培养，并进行流加补料液C的补料发酵培养；发酵结束后，从发酵培养液中分离纯化出该结构化合物。4.根据权利要求3所述的化合物的发酵制备方法，其特征是：诺尔斯氏链霉菌Streptomycesnoursei的遗传改良菌株为诺尔斯氏链霉菌LSP-1，StreptomycesnourseiLSP-1,已于2018年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为C...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭红，周金燕，钟娟，杨杰，
申请(专利权)人：中国科学院成都生物研究所，
类型：发明
国别省市：四川,51