一种孔内定标测试方法技术

本发明专利技术公开了一种孔内定标测试方法，包括如下步骤：制备复合微珠悬浮液，并与检测样本在同一个检测微孔中混合，加入荧光标记物，采用流式荧光仪检测所述检测微孔中各微珠的荧光值，根据标准微珠的检测值拟合成标准曲线，根据参考微珠的检测值拟合成辅助曲线，根据空白微珠的检测值监测体系中是否有非特异性反应，并将检测微珠的检测值与标准曲线对比后获得检测样本的定性和定量结果。本发明专利技术实现同一孔内检测项目根据同一孔的标准曲线进行计算，有效解决了外部标准曲线始终无法解决的标准曲线和检测项目反应时间、反应环境、反应温度的一致性问题，提高了结果精准度，并可有效监测、排除漏加样、洗板不充分、样本干扰等异常情况。

An in-hole calibration test method

The invention discloses an in-hole calibration test method, which comprises the following steps: preparing composite microsphere suspension, mixing it with the test sample in the same detection micropore, adding fluorescent markers, detecting the fluorescence value of each microsphere in the detection micropore by flow fluorescence meter, fitting the standard curve according to the detection value of the standard microsphere, and fitting complementary according to the detection value of the reference microsphere. Aid curve, according to the detection value of blank beads, whether there is a non-specific reaction in the monitoring system, and compare the detection value of the detection beads with the standard curve to obtain the qualitative and quantitative results of the detection samples. The method realizes the calculation of the test items in the same hole according to the standard curves of the same hole, effectively solves the consistency problem of the standard curves and the test items'reaction time, reaction environment and reaction temperature that can not be solved by the external standard curves, improves the accuracy of the results, and effectively monitors and eliminates the abnormal situations such as missing sample addition, insufficient washboard, sample interference, etc.

【技术实现步骤摘要】
一种孔内定标测试方法
本专利技术涉及生物检测领域，具体涉及在一个检测孔内同时进行定标校准和检测的方法。
技术介绍
传统定标方法一般每次实验先取几个孔做标准曲线，然后不同样本的检测结果都根据这同一条标准曲线进行计算，是一种外部定标分析方法，这种方法的缺点是做标准曲线的实验和样本检测是两个完全独立的实验，因为它们的反应时间、反应温度、反应环境都不同，固定的标准曲线无法校正此类偏差。另外漏加样可能会导致假阴性结果，或洗板不充分，例如ELISA/化学发光法，洗板不充分一般导致假阳性结果。由于免疫反应加样量一般都很少，即使发生漏加样，溶液体积也没有明显变化，无法及时发现并纠正。采用传统定标方法，漏加样时，该孔的检测结果会很低，存在将阳性结果误报为假阴性的风险。如果洗板不充分，传统的ELISA等实验的结果可能会异常偏高，导致检测结果的假阳性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种孔内定标测试方法，以解决
技术介绍
存在的上述缺陷。本专利技术是通过如下的技术方案实现的：一种孔内定标测试方法，包括如下步骤：步骤一，选择n种微珠包被不同浓度梯度的人IgG抗原，获得n种标准微珠；步骤二，选择m种微珠包被不同浓度梯度的抗人IgG，获得m种参考微珠；步骤三，选择一种微珠不包被任何抗原，作为空白微珠；步骤四，选择a种微珠包被与检测样本抗体相对应的抗原，获得a种检测微珠；步骤五，将所述标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠转移至样本稀释液并混合，得到复合微珠悬浮液；步骤六，稀释检测样本，将所述复合微珠悬浮液与稀释后的检测样本在过滤板的一个检测微孔中混合，温育；步骤七，洗涤，然后加入荧光标记物，温育；步骤八，采用流式荧光仪检测所述检测微孔中各微珠的荧光值，其中根据标准微珠的检测值拟合成标准曲线；根据参考微珠的检测值拟合成辅助曲线，监测是否存在严重异常；根据空白微珠的检测值监测体系中是否有非特异性反应；并将检测微珠的检测值与标准曲线对比后获得检测样本的定性和定量结果；其中，n＝1-20、m＝1-20、a＝1-50；所述微珠是经不同的荧光染料染色并编码的聚苯乙烯微球；上述各步骤中微珠的编码均不相同。优选的，所述微珠的直径为5-7微米，最好是5.6微米。所述标准微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含2-18ug人IgG(免疫球蛋白G)的比例加入人IgG，充分混合。所述微珠活化液，是将1000单位体积微珠加入反应管，加入5-50单位体积EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)和5-50单位体积Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)活化而成。所述参考微珠采用如下方法制备：制备微珠活化液，然后按照每毫升微珠中包含8-15ug抗人IgG的比例加入抗人IgG，充分混合。步骤二中所述抗人IgG，可以是羊抗-人IgG、兔抗-人IgG或鼠抗-人IgG等。所述空白微珠即没有加入任何抗原的微珠活化液。优选的，所述标准曲线和辅助曲线，是选取线性、三次样条、逻辑蒂斯4P、逻辑蒂斯5P中的任意一种方法拟合的。作为优选的技术方案，所述荧光标记物是藻红蛋白标记的羊抗-人IgG(特异性γ链)。步骤五中所述样本稀释液是含磷酸盐的缓冲液。优选的，样本稀释液中各组分的组成及含量如下：本专利技术方法是基于流式荧光技术。流式荧光技术以1-100号微球作为反应固相载体，不同编码的微球分别包被不同的抗原或抗体，变成不同的检测微珠，再将这些检测微珠按照一定的比例混合在一起。可一管同时定量检测1-100种不同的生物分子；具有高通量、高灵敏度、并行检测等特点。本专利技术是在上述技术的基础上，在混合检测微珠中额外添加了标准微珠、参考微珠和空白微珠来实现同一孔内的定标和校正。标准微珠用于绘制标准曲线，用于检测微珠的结果计算；参考微珠用于生成辅助曲线，辅助监测判断实验过程中是否存在严重异常，如漏加样本、洗板不充分、样本中存在严重干扰物质等；空白微珠可以监测反应体系中是否有非特异性反应。本专利技术采用1-n种标准微珠(每种标准微珠的微珠编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠、参考微珠的编码也不同)，获得标准曲线。通过在1-n种微球上包被不同梯度的人IgG抗原，结合了不同梯度人IgG的标准微珠会与荧光标记物充分结合反应，在检测时发出不同梯度强度的荧光强度。通过线性、三次样条、逻辑蒂斯4P、逻辑蒂斯5P等拟合回归曲线，本孔内的检测项目都只通过本孔拟合的曲线进行计算。本专利技术采用1-m种参考微珠(每种参考微珠的微球编码均不同，并且与空白微珠、检测微珠、标准微珠的编码也不同)获得辅助曲线。通过在1-m种微球个上包被不同梯度的xx抗人IgG(如：羊抗人IgG，兔抗人IgG等)，参考微珠与检测微珠一样，先与血清中的IgG抗体结合反应，洗板后，再与荧光标记物结合，最后上机检测。通过线性、三次样条、逻辑蒂斯4P、逻辑蒂斯5P等拟合辅助曲线，辅助曲线来验证结果是否在一定的范围内，判断实验过程(加样、洗板等)或样本是否异常，避免直接报告假阳性或假阴性。本专利技术采用1种空白微珠(微珠编码与上述各种微珠的编码均不同)，作为对照，包被步骤与检测微珠的包被相同，但包被时的抗原用稀释液代替。空白微珠可以用于监测样本中是否存在严重的非特异反应。空白微珠检测的荧光值一般比较低，如果样本中存在严重的非特异反应，导致空白微珠发生了非特异反应，荧光值就会异常升高，系统会进行报警而不是直接显示结果，避免报告错误的假阳性结果。本专利技术的孔内定标测试方法，将标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠混合后，一起加入到同一个检测孔内，参与实验的反应，反应时间、反应温度、反应环境都完全一致，标准微珠获得的实验结果拟合成标准曲线，参考微珠获得的实验结果拟合成辅助曲线，同一个检测孔中的检测项目通过同一个检测孔的标准曲线和辅助曲线来计算。如果实验过程中漏加样本，标准曲线的结果正常，而辅助曲线的结果异常(没有血清中的IgG抗体与参考微珠结合)，在此种情况下，软件会给出报警，而不是和传统标准曲线一样直接报告错误的假阴性结果。如果洗板不充分(如洗板机针头堵塞，洗液瓶用空，漏加洗液等)，多余的IgG会和标准微珠、参考微珠和检测微珠竞争结合荧光标记物，标准微珠、参考微珠和检测微珠的检测结果都会比正常洗板情况下要同步减少，通过标准微珠的校正，即标准微珠和检测微珠的检测结果同步减少，使得检测结果得到一定的修正而更准确。另外，如果标准微珠或参考微珠结果超出一定范围，异常偏低，软件也会进行报警，提示结果异常，避免发出错误的报告。如果样本中含有干扰物质，空白微珠、标准微珠、参考微珠和检测微珠的检测结果都会比正常情况下要同步增加，通过标准微珠的校正，最后的检测结果会更准确。另外，如果空白微珠、标准微珠或参考微珠结果超出一定范围，异常偏高，软件也会进行报警，提示结果异常，避免发出错误的报告。本专利技术孔内定标检测方法的创新点在于：可以在每个检测孔内绘制独立的标准曲线，同一孔内的检测项目根据同一孔的标准曲线进行计算，不但节约了试剂用量，而且有效解决了外部标准曲线始终无法解决的标准曲线和检测项目反应时间、反应环境、反应温度的一致性问题，提高了结果的精准度；另外提供联合运用设计的标准曲线和参考曲线，可以有效监测漏加样、洗板不充分、样本有干扰等异常情况，避免直接报本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种孔内定标测试方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，选择n种微珠包被不同浓度梯度的人IgG抗原，获得n种标准微珠；步骤二，选择m种微珠包被不同浓度梯度的抗人IgG，获得m种参考微珠；步骤三，选择一种微珠不包被任何抗原，作为空白微珠；步骤四，选择a种微珠包被与检测样本抗体相对应的抗原，获得a种检测微珠；步骤五，将所述标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠转移至样本稀释液并混合，得到复合微珠悬浮液；步骤六，稀释检测样本，将所述复合微珠悬浮液与稀释后的检测样本在一个检测微孔中混合，温育；步骤七，洗涤，然后加入荧光标记物，温育；步骤八，采用流式荧光仪检测所述检测微孔中各微珠的荧光值，其中根据标准微珠的检测值拟合成标准曲线；根据参考微珠的检测值拟合成辅助曲线，监测是否存在严重异常；根据空白微珠的检测值监测体系中是否有非特异性反应；并将检测微珠的检测值与标准曲线对比后获得检测样本的定性和定量结果；其中，n＝1‑20、m＝1‑20、a＝1‑50；所述微珠是经不同的荧光染料染色并编码的聚苯乙烯微球；上述各步骤中微珠的编码均不相同。

【技术特征摘要】
1.一种孔内定标测试方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，选择n种微珠包被不同浓度梯度的人IgG抗原，获得n种标准微珠；步骤二，选择m种微珠包被不同浓度梯度的抗人IgG，获得m种参考微珠；步骤三，选择一种微珠不包被任何抗原，作为空白微珠；步骤四，选择a种微珠包被与检测样本抗体相对应的抗原，获得a种检测微珠；步骤五，将所述标准微珠、参考微珠、空白微珠和检测微珠转移至样本稀释液并混合，得到复合微珠悬浮液；步骤六，稀释检测样本，将所述复合微珠悬浮液与稀释后的检测样本在一个检测微孔中混合，温育；步骤七，洗涤，然后加入荧光标记物，温育；步骤八，采用流式荧光仪检测所述检测微孔中各微珠的荧光值，其中根据标准微珠的检测值拟合成标准曲线；根据参考微珠的检测值拟合成辅助曲线，监测是否存在严重异常；根据空白微珠的检测值监测体系中是否有非特异性反应；并将检测微珠的检测值与标准曲线对比后获得检测样本的定性和定量结果；其中，n＝1-20、m＝1-20、a＝1-50；所述微珠是经不同的荧光染料染色并编码的聚苯乙烯微球；上述各步骤中微珠的编码均不相同。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微珠的直径为5-7微米。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准微珠采用如...

【专利技术属性】
技术研发人员：宣生良，
申请(专利权)人：一滴准生物科技常州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32