一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒，包括胰腺癌组织切片制作试剂、组织染色试剂，以及肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛的长度高风险阈值和/或密度高风险阈值。本发明专利技术利用免疫荧光染色和激光共聚焦的扫描重建方法，重建肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛完整结构，通过软件测量基底微绒毛的物理参数密度和长度，与胰腺病人术后复发时间进行分析，利用基底微绒毛的物理参数长度和密度的均值和中位数预测胰腺癌病人手术后的复发风险。微血管内皮细胞基底微绒毛只存在于恶性肿瘤内，并且该指标是病理学技术指标，属于肿瘤诊断黄金标准范畴，因此这个指标的特异性远高于其它影像学指标。

A Kit for Predicting Postoperative Recurrence Risk of Pancreatic Cancer

The invention discloses a kit for predicting the risk of recurrence of pancreatic cancer after operation, including a reagent for making pancreatic cancer tissue slices, a tissue staining reagent, and a high risk threshold for the length and/or density of the basal microvilli of tumor microvascular endothelial cells. The method of scanning reconstruction by immunofluorescence staining and laser confocal focusing is used to reconstruct the complete structure of the basal microvilli of tumor microvascular endothelial cells. The density and length of the basal microvilli are measured by software, and the recurrence time of pancreatic patients is analyzed. The mean and median of the length and density of the basal microvilli are used to predict the hand of pancreatic cancer patients. Postoperative recurrence risk. The basal microvilli of microvascular endothelial cells only exist in malignant tumors, and this index is a pathological and technical index, which belongs to the golden standard of cancer diagnosis. Therefore, the specificity of this index is much higher than other imaging indicators.

【技术实现步骤摘要】
一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒
本专利技术属于临床肿瘤功能检测和病理诊断领域，涉及一种预测胰腺癌术后复发风险的试剂盒。
技术介绍
胰腺癌是一种致死率极高的肿瘤，其发病率和死亡率几乎一致。胰腺癌在美国癌症死亡率中占第四位，在欧洲占第五位(Siegeletal.,2016)。近几十年来，我国胰腺癌的发病率和死亡率快速上升(马臣etal.,2013)。据2017中国癌症报告，胰腺癌已成为大城市人口死亡的主要五大肿瘤之一。目前，胰腺癌的主要治疗方法仍是手术切除。尽管胰腺癌的手术技术已有长足进步，但其术后的长期生存率仍十分有限(Vincentetal.,2011)。术后大部分病人会接受辅助化疗，但超过70％的病人在术后1年内复发或更短时间内复发。在临床实践过程中，预测胰腺癌病人术后复发风险是一件极难的工作。复发的风险等级对胰腺癌病人的术后治疗方案的制定和随访具有很高的指导意义。可惜的是，目前没有一个临床上可以用的可靠指标。目前，胰腺癌的转移、复发预测大部分仍依赖传统的指标如血清CA19-9、Span1、淋巴结转移、肿瘤分化程度等(Hosokawaetal.,2017；Kimetal.,2016)。但预测的敏感性和特异性都不佳，如果能找到更好的预测胰腺癌复发指标，对胰腺癌的治疗和判断预后有着重要的意义，并能给患者带来生存获益。病理学诊断是诊断“黄金标准”。病理学诊断技术依赖组织的平面结构做出诊断，组织的平面结构无法提供组织内部细胞在空间中的立体状态，例如细胞突起和细胞之间相互作用等功能相关信息。然而，这些功能相关信息中可能包含了许多肿瘤独特行为或功能的信息。为了探索这些功能相关信息，本专利技术人通过技术创新和长时间摸索，建立了一套病理切片3D免疫荧光染色技术。这项技术弥补了传统病理学的不足之处，3D免疫荧光染色不仅提供清晰的组织结构图，而且可以显示肿瘤内部细胞之间的空间分布及完整的细胞结构。在前期研究中，本专利技术人发现胰腺癌微循环中存在一种特殊的“毛毛虫”似的毛细血管，这些血管内皮细胞基底面有基底微绒毛。基底微绒毛的超微结构和物质运输系统均显示此微绒毛具有物质交换能力(Saiyinetal.,2015)。同时，本专利技术人也观察到了在易复发的胰腺癌中基底微绒毛异常发达，而在不易复发的肿瘤中基底微绒毛相对少。糖摄取能力高的肿瘤微血管基底微绒毛异常长，可以达到血管直径的10倍，有的甚至可以达到胰腺癌导管内部(Saiyinetal.,2015)。因此，我们推测基底微绒毛可能是胰腺癌获取营养物质的主要通道，微绒毛的参数，例如长度和密度等，可能反映该肿瘤的细胞的改造微环境的能力，从而获取更多营养的物质。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术人利用激光共聚焦断层扫描技术，重建免疫荧光染色后的81例胰腺癌病人的肿瘤微血管，测量了微血管内皮细胞基底微绒毛的参数，并与病人的术后复发情况进行相关性分析，发现血管内皮细胞基底微绒毛的长度和密度与胰腺癌的复发风险呈高度相关。进而，本专利技术提供了一种预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，包括胰腺癌组织切片制作试剂、组织染色试剂，以及肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛的长度高风险阈值和/或密度高风险阈值，所述长度高风险阈值和密度高风险阈值的判定标准为以下三种中的任意一种：b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值时，判定为复发高风险；b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险；c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值，且平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险。进一步，所述复发高风险是指根据COX模型，胰腺癌根治术后患者相比复发低风险相对危险度RR＝eβ，RR>1。或者，所述复发高风险的平均复发率高于所述复发低风险的平均复发率，优选为1.2倍以上或1.6倍以上，进一步优选为2倍以上或3倍以上。优选地，所述长度高风险阈值为11.14-11.87μm；在本专利技术的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均长度作为判定标准，其长度高风险阈值为11.87μm；在本专利技术的另一种优选实施方式中，以基底微绒毛中位数长度作为判定标准，其长度高风险阈值为11.14μm。优选地，所述密度高风险阈值为334-361个/mm2；在本专利技术的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均密度作为判定标准，其密度高风险阈值为361个/mm2；在本专利技术的另一种优选实施方式中，以基底微绒毛中位数密度作为判定标准，其密度高风险阈值为334个/mm2。进一步，本专利技术提供了COX比例风险回归模型h(t,X)＝h0(t)exp(βX)，其中X为微绒毛长度(单位：μm)或微绒毛密度(单位：个/mm2)，β为回归系数，t为时间点(单位：天)，h0(t)为基准风险函数，理解为基准人(例如低风险患者)的风险函数；h(t,X)表示具有X微绒毛长度的患者，在时间点t的复发风险率，h(t,X)越大风险越大，h(t,X)越小风险越小。其中，X可以为微绒毛平均长度或中位数长度，也可以为微绒毛的平均密度或中位数密度。胰腺癌根治术后患者相比复发低风险的相对危险度RR＝eβ，RR>1为高风险。在本专利技术的一种优选实施方式中，以基底微绒毛平均长度作为判定标准，高风险阈值为11.87μm，此时β＝1.315，其平均效果为相对危险度(RR)＝e1.315＝3.724，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度大于11.87μm时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是平均长度小于11.87μm患者的3.724倍。在本专利技术的另一优选实施方式中，以基底微绒毛中位数长度作为判定标准，高风险阈值为11.14μm，此时β＝1.244，其平均效果为相对危险度(RR)＝e1.244＝3.470，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛中位数长度大于11.14μm时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是中位数长度小于11.14μm患者的3.470倍。在本专利技术的又一优选实施方式中，以基底微绒毛平均密度作为判定标准，高风险阈值为361个/mm2，此时β＝0.476，其平均效果为相对危险度(RR)＝e0.476＝1.609，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度大于361个/mm2时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是平均密度小于361个/mm2患者的1.609倍。在本专利技术的再一优选实施方式中，以基底微绒毛中位数密度作为判定标准，高风险阈值为334个/mm2，此时β＝0.205，其平均效果为相对危险度(RR)＝e0.205＝1.228，意为当患者微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度大于334个/mm2时，该患者在任意时间点的平均复发风险都是中位数密度小于334个/mm2患者的1.228倍。优选地，选择胰腺癌组织中微绒毛最多的微血管测量微绒毛的长度和/或密度。优选地，所述组织切片为组织厚切片，厚度优选为40-50μm。优选地，所述组织染色是3D免疫荧光染色。进一步，本专利技术所述预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒还包括图像分析软件；优选为ImageJ软件。在本专利技术的一种优选实施方式中，采用激光共聚焦显微镜对染色后的组织进行扫描拍照，然后采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，其特征在于，包括胰腺癌组织切片制作试剂、组织染色试剂，以及肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛的长度高风险阈值和/或密度高风险阈值，所述长度高风险阈值和密度高风险阈值的判定标准为以下三种中的任意一种：a.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值时，判定为复发高风险；b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险；c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值，且平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险。

【技术特征摘要】
1.一种预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，其特征在于，包括胰腺癌组织切片制作试剂、组织染色试剂，以及肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛的长度高风险阈值和/或密度高风险阈值，所述长度高风险阈值和密度高风险阈值的判定标准为以下三种中的任意一种：a.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值时，判定为复发高风险；b.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险；c.当肿瘤微血管内皮细胞基底微绒毛平均长度或中位数长度大于所述长度高风险阈值，且平均密度或中位数密度大于所述密度高风险阈值时，判定为复发高风险。2.如权利要求1所述的预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，其特征在于，所述长度高风险阈值为11.14-11.87μm。3.如权利要求1所述的预测胰腺癌的术后复发风险的试剂盒，其特征在于，所述密度高风...

【专利技术属性】
技术研发人员：楼文晖，韩序，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31