一种具有抗氧化功效的合成多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种具有抗氧化功效的合成多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用。本发明专利技术采用Fmoc固相合成方法，采用固相合成树脂为载体，从多肽的C端到N端在混合偶联剂作用下，按照氨基酸序列的排列方式，逐一地将氨基酸与固相合成树脂偶联，合成含有目标多肽片段的树脂，进而通过裂解脱除剂作用下，使得外层树脂裂解并脱去侧链的Fmoc保护基，目标多肽从固相载体中被切下来，经分离纯化后可得到具有抗氧化功效的多肽。本发明专利技术的合成方法操作简单，合成时间短，副产物少，且合成成本较低。本发明专利技术合成多肽具有显著的体外抗氧化活性，效果良好，可用于制备具有抗氧化和缓解衰老相关的保健食品及药品领域，安全性高且应用广泛，具有很好的市场前景。

A synthetic polypeptide with antioxidant activity and the gene encoding the polypeptide, its preparation method and Application

The invention discloses a synthetic polypeptide with antioxidant effect, a gene encoding the polypeptide, a preparation method and application thereof. The invention adopts Fmoc solid-phase synthesis method, uses solid-phase synthetic resin as carrier, and under the action of mixed coupling agent from C to N ends of polypeptide, according to the arrangement of amino acid sequence, the amino acid is coupled with the solid-phase synthetic resin one by one to synthesize the resin containing target polypeptide fragments. Then, under the action of cracking eliminator, the outer resin is cracked and the Fmoc guarantees of side chains are removed. Protective group and target polypeptide were cut off from solid phase carrier and purified to obtain polypeptide with antioxidant effect. The synthesis method of the invention has the advantages of simple operation, short synthesis time, less by-products and low synthesis cost. The synthetic polypeptide of the invention has remarkable antioxidant activity in vitro and good effect, and can be used to prepare health food and medicine fields related to antioxidant and anti-aging, with high safety and wide application, and has good market prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种具有抗氧化功效的合成多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用
本专利技术属于多肽
，具体涉及一种具有抗氧化功效的合成多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用。
技术介绍
多肽是由氨基酸通过酰胺键连接形成，在生物体内可作为神经递质、激素等信号因子，通过与受体相互作用进行信息传导和信息交流。多肽对靶分子具有特异性识别的特征，以多肽为分子探针识别的靶向药物运输体系被广泛应用于医药及材料领域。体外合成多肽是深入研究其功能、生物化学性质及应用的重要方法。相比生物制备方法，化学合成法制备周期短，且能实现自动化生产。目前，多肽的固相合成(SPPS)已成为多肽制备的主要方法之一，不仅可以合成天然氨基酸多肽，还能根据需求合成非天然氨基酸的多肽，大大增加了合成多肽的种类和性质。由于不同氨基酸之间的侧链基团结构不同，其化学性质也具有较大的差异，从而使链长的多肽在固相载体树脂偶联时效率低。此外，氨基酸残基的消旋及特殊位点的修饰等副反应，导致最终合成多肽纯度较低。因此，进一步提高多肽合成效率及纯度是目前面临的主要问题。多肽固相合成方法可以分为两大类：Boc固相合成法和Fmoc固相合成法，两种方法合成原理基本一致，但采用的保护基不同，后续偶联剂、脱除剂及反应条件也有很大的差异。BMerrrifield在合成血管舒缓激肽时，采用Boc作为氨基酸的保护基，是经典的多肽固相合成法。近年来，有大量的研究表明Boc法的使用效率低，反应不完全，同时出现很多副反应产物的积累，因此Boc逐渐被Fmoc所取代。Fmoc固相合成法是使用Fmoc保护氨基酸的氨基，Fmoc对酸稳定，可采用碱性化合物作为脱保护剂。相比Boc固相合成方法反应，Fmoc法具有条件温和、副反应少、产物周期短、成本低等优势。在固相合成过程中，除氨基酸氨基端的保护基外，载体树脂的结构和性能对氨基酸偶联及多肽链的延长产生很大的影响，从而影响目标多肽的生产效率和纯度。因此，寻求更有效的载体树脂、裂解基及脱除保护剂是进一步优化Fmoc固相合成法，提高其产物效率和纯度的有效方法。氧化反应不仅影响食品的质量而且危害人体健康，因此抗氧化剂在国内外发展很快，不仅用于脂肪类食品的抗氧化，并且可作为功能因子添加入保健品、药品及化妆品中应用。人体在正常生理代谢过程中会产生自由基，这些自由基在人体抗氧化酶作用下可维持在一定水平。当人体处于病理状态或进入老年阶段时，自由基由于不能被即时处理而堆积在细胞内，进而与机体内大分子物质反应产生过氧化物，导致细胞吸收代谢及能量代谢异常。人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关，食品工业中常用的抗氧化剂BHA、BHT具有很好的清除自由基作用，但其本身具有毒副作用。从食物中鉴定并合成的抗氧化活性肽，具有良好的生物相容性、且毒副作用小，相对氨基酸和蛋白质更容易被人体吸收利用。Wang等用麦麸蛋白经木瓜蛋白酶水解所得生物活性肽，具有较强的自由基清除能力。沈蓓英将大豆分离蛋白经酸水解后，制备得到分子量在700Da的多肽，对自由基具有很好的清除作用。研究表明，骨骼肌中的肌肽、金枪鱼酶解后多肽等具备显著的抗氧化活性。抗氧化活性肽具有生物活性高、毒性小等特定，近年来已有部分科研工作者奠定研究基础，揭示多肽作为保健食品、化妆品及药物的潜力。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供了一种具有抗氧化功效的合成多肽及编码该多肽的基因与其制备方法和应用，本专利技术的合成多肽具有清除自由基能力。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现。一种具有抗氧化功效的合成多肽，其氨基酸序列为NH2-Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn-COOH，如SEQIDNO：1所示。编码所述合成多肽的基因，其DNA碱基序列如SEQIDNO：2所示。制备所述一种具有抗氧化功效的合成多肽的方法，其采用氨基酸氨基保护基Fmoc固相合成，按照SEQIDNO：1所示多肽的氨基酸序列，采用固相合成树脂为载体，从多肽的C端到N端在混合偶联剂作用下，按照氨基酸序列的排列方式，逐一地将氨基酸与固相合成树脂偶联，从而得到含有目标多肽片段的多肽树脂，再经通过裂解脱除剂作用下，使目标多肽从固相载体中脱除出来，进一步经分离纯化及抗氧化功能筛选后，即可得到具有较高纯度的及氧化功效的合成多肽。进一步的，所述固相合成树脂为2-CTC树脂，相比于Wang树脂和传统的HMBA-AM树脂和PAM树脂，反应条件更温和，副反应少，产物纯度更高。进一步的，所述氨基酸氨基保护基团为Fmoc基团。进一步的，所述混合偶联剂采用2-羟基苯丙三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙混合偶联剂，且其优选用量为2-羟基苯丙三氮唑0.259g，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯0.728g和N,N-二异丙基乙混合偶联剂300μL。进一步的，所述裂解脱除剂为三氟乙酸、乙二硫醇和水的混合溶液，且优选体积比三氟乙酸：乙二硫醇：水＝95:2.5:2.5。进一步的，所述合成多肽的Fmoc固相合成方法，按照所述合成多肽氨基酸序列特征从C端到N端进行逐一偶联延伸的合成方法。进一步的，本专利技术提供了编码合成多肽的基因，本领域技术人员通过其碱基排列经转录便可得相应的DNA分子，并进一步可制备得到该合成多肽。本专利技术所述的多肽为：NH2-Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn-COOH，其中，Pro表示英文名称为Proline，中文名称为脯氨酸的氨基酸残基；Gly表示英文名称为Glysine，中文名称为谷氨酸的氨基酸残基；Ala表示英文名称为Alanine，中文名称为丙氨酸的氨基酸残基；Cys表示英文名称为Cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸残基；Ser表示英文名称为Serine，中文名称为丝氨酸的氨基酸残基；Asn表示英文名称为Asparagine，中文名称为天冬酰胺的氨基酸残基。进一步的，在本专利技术具体实施方式中，按照SEQIDNO：1所示序列，采用Fmoc作为氨基酸的氨基保护基团，以2-CTC树脂进行偶联，具体地按照从脯氨酸的C端到天冬酰胺的N端氨基酸顺序脱除保护基，并采用偶联剂进行逐一偶联，然后使用裂解脱除剂切下树脂和侧链保护基，获得多肽粗品，经进一步分离纯化后获得目标多肽。进一步的，本专利技术所述多肽合成方法，氨基酸与树脂偶联前需对Fmoc保护的氨基酸进行脱除Fmoc处理。具体实施例中，所述脱除Fmoc的试剂为20％哌啶的二甲基甲酰胺溶液，搅拌反应时间30min，即可除去Fmoc保护基。进一步的，本专利技术所述多肽合成方法，其中固相载体树脂2-CTC的裂解脱除剂优选为三氟乙酸、乙二硫醇和水的混合溶液，其中三氟乙酸：乙二硫醇：水＝95:2.5:2.5(体积比)。进一步的，本专利技术所述合成方法，其多肽分离纯化方法采用RP-HPLC反相高效液相色谱仪纯化，同时并进行质谱鉴定。进一步的，本专利技术采用体外DPPH·清除能力和氧自由基吸收能力(ORAC)方法检测了合成多肽清除自由基的能力，结果表明合成多肽DPPH·清除能力对表现出显著剂量依赖效应，同时对过氧自由基的结合能力比抗氧化剂谷胱甘肽的活性更强。本专利技术制得具有抗氧化功效的合成多肽不仅能在制备抗氧化保健食品中应用，还能在缓解衰老药物中应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有抗氧化功效的合成多肽，其特征在于氨基酸序列为NH2‑Pro‑Gly‑Ala‑Cys‑Ser‑Asn‑ COOH，如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有抗氧化功效的合成多肽，其特征在于氨基酸序列为NH2-Pro-Gly-Ala-Cys-Ser-Asn-COOH，如SEQIDNO：1所示。2.编码权利要求1所述合成多肽的基因，其DNA碱基序列如SEQIDNO：2所示。3.制备权利要求1所述一种具有抗氧化功效的合成多肽的方法，其特征在于采用氨基酸氨基保护基团固相合成，按照SEQIDNO：1所示多肽的氨基酸序列排列顺序，采用固相合成树脂为载体，从多肽的C端到N端在混合偶联剂作用下，按照氨基酸序列的排列方式，逐一地将氨基酸与固相合成树脂偶联，从而得到偶联目标多肽片段的多肽树脂，再经通过裂解脱除剂作用下，使目标多肽从固相载体中释放下来，得到粗多肽，进一步分离纯化及抗氧化功能筛选后，即可得到具有抗氧化功效的多肽。4.根据权利要求3所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：任娇艳，李宇娟，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44