一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒。该试剂盒主要包括：G6PD第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物11对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂。本发明专利技术的试剂盒用于检测G6PD缺乏症致病基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断，降低G6PD缺乏症的发病率。

【技术实现步骤摘要】
一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒
本专利技术涉及生物
，具体涉及检测G6PD缺乏症致病基因是否发生突变的试剂盒。
技术介绍
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphatedehyDrogenase,G6PD)缺乏症是一种常见的X连锁不完全显性遗传病。G6PD缺乏症呈世界性分布，但相对集中在非洲、地中海沿岸、中近东及东南亚、美洲黑人、中美洲及南美洲某些印第安人。我国主要分布在黄河流域以南各省，尤以广东、广西、贵州、云南和四川等省发生率较高，约为5％～20％，个别地区高达40％。遗传性G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性遗传，通常显性遗传的特点是父母任一方的致病基因只要传给子女，都可导致发病。有些携带显性遗传基因的个体可无临床表现，即外显率不是100％，这种情况就是不完全显性。正如G6PD缺乏症一样，因属于X连锁，群体中出现外显不全现象，故称X连锁不完全显性遗传。G6PD缺乏症男性明显多于女性，是因为男性只有一条X染色体，当G6PD基因突变时，酶活性表现为显著缺失；女性有两条X染色体，当其中一条X染色体的G6PD基因突变时，且另外一条X染色体正常时，就在体内形成两类红细胞的“嵌合体”，该女性为G6PD缺乏症基因携带者，其酶活性变化范围很大，可以表现正常，也可表现为显著缺乏；当女性两条X染色体的G6PD基因发生突变时，其酶活性可以表现为中度或显著缺乏。G6PD缺乏症的分子基础是基因突变，G6PD基因位于x染色体长臂的2区8带(Xq28)，基因全长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码区长1548bp，编码515个氨基酸。随着对G6PD分子结构的不断阐明和研究的不断深入，用WHO标准化方法鉴定的G6PD生化变异型达400余种，基因突变型达到160余种。在中国人群中，A95G、G1376T、G1388A、G871T、C1024T等5种突变类型是中国人群中最常见基因突变型，约占总突变率的90％以上。目前国内外对G6PD缺乏症患者的诊断方法主要有血红蛋白尿检、高铁血红蛋白还原试验、变性珠蛋白小体生成试验、GSH含量测定、荧光斑点法和红细胞G6PD活性测定等试验。虽然，酶学检测能够对男性半合子及女性纯合子进行准确检出，但是对G6PD缺乏症基因携带者的“杂合子”女性患者(其酶活性变化范围很大：既可表现为正常，也可低至半合子水平)酶活性检测很难检出，也是G6PD缺乏症目前实验室漏检的主要原因。除此之外，这些生化检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可应用于产前诊断，降低G6PD缺乏症的发病率。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，包括以下成分：(1)G6PD第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物11对，引物序列如表1所述；(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、TaqDNA聚合酶等；(3)常规PCR产物纯化试剂，如普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等；(4)常规DNA测序试剂，如BigDyemix、EDTA溶液、乙醇溶液、HI-DI溶液等。表1G6PD基因第1到第13外显子区的PCR扩增与测序引物序列所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的试剂盒通过下述方法用于检测G6PD缺乏症致病基因突变，包括以下步骤：(1)、提取样本的基因组DNA；(2)、G6PD基因PCR扩增采用权利要求1所述引物序列；每个PCR扩增体系总体积为15μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)，去离子水5.5μL，引物(l0uM)0.5μL，基因组DNA(100ng/ul)1ul；PCR反应条件为94℃3分钟，进行14个循环的94℃30秒，62℃30秒，72℃40秒；然后进行30个循环的94℃30秒，55℃30秒，72℃40秒，最后进行72℃10分钟；(3)、PCR产物纯化采用天根普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作步骤进行割胶纯化PCR产物，获得相应目的DNA片段；(4)、DNA测序反应每个反应体系总体积为10μL，包括PCR纯化产物1μL、BigDyemix(Bigdye、5×seq)2.2μL和测序引物0.5μL，余量为去离子水；反应条件为96℃1min，进行33个循环的96℃10sec，56℃10sec，60℃2.5min；反应结束后每管内加入2.5μLEDTA，30μL100％乙醇，盖好，震荡4次，避光静置15分钟，3860rpm，25℃离心40min，吸弃上层液体；加入100μL70％预冷乙醇，盖好，3860rpm，25℃离心15分钟，吸弃上层液体；让酒精在室温挥发干净，加入8μLHi-Di溶解DNA；在PCR仪上变性：95℃4分钟，冰上静置4分钟，放入测序仪中。与现有技术相比，本专利技术实现的有益效果：(1)本专利技术可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，可广泛应用于产前诊断，降低G6PD缺乏症的发病率；(2)本专利技术能够准确判别受检人员基因型属于杂合突变还是纯合突变，从而降低漏诊杂合突变携带者的概率；(3)本专利技术基于PCR反应和一代测序的方法，进行SNP检测，准确性得到显著提高。附图说明图1是实施例2中G6PD基因第1外显子测序结果示意图；图2是实施例2中G6PD基因第2外显子测序结果示意图；图3是实施例2中G6PD基因第3外显子测序结果示意图；图4是实施例2中G6PD基因第4外显子测序结果示意图；图5是实施例2中G6PD基因第5外显子测序结果示意图；图6是实施例2中G6PD基因第6外显子测序结果示意图；图7是实施例2中G6PD基因第7外显子测序结果示意图；图8是实施例2中G6PD基因第8外显子测序结果示意图；图9是实施例2中G6PD基因第9外显子测序结果示意图；图10是实施例2中G6PD基因第10外显子测序结果示意图；图11是实施例2中G6PD基因第11外显子测序结果示意图；图12是实施例2中G6PD基因第12外显子测序结果示意图；图13是实施例2中G6PD基因第13外显子测序结果示意图；图14是实施例3中G6PD基因第2外显子测序结果示意图；图15是实施例3中G6PD基因第3外显子测序结果示意图；图16是实施例3中G6PD基因第4外显子测序结果示意图；图17是实施例3中G6PD基因第5外显子测序结果示意图；图18是实施例3中G6PD基因第6外显子测序结果示意图；图19是实施例3中G6PD基因第7外显子测序结果示意图；图20是实施例3中G6PD基因第8外显子测序结果示意图；图21是实施例3中G6PD基因第9外显子测序结果示意图；图22是实施例3中G6PD基因第10外显子测序结果示意图；图23是实施例3中G6PD基因第11外显子测序结果示意图；图24是实施例3中G6PD基因第12外显子测序结果示意图；图25是实施例3中G6PD基因第13外显子测序结果示意图。具体实施方式为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将结合各个实施例作进一步描述。实施例1一人份检测G6PD缺乏症致病基因是否发生突变的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括以下成分：G6PD第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物11对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；所述引物序列为：

【技术特征摘要】
1.一种检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括以下成分：G6PD第1到第13外显子编码区PCR扩增与测序引物11对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；所述引物序列为：2.如权利要求1检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1检测G6PD缺乏症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，通过下述检测G6PD缺乏症致病基因突变，(1)、提取样本的基因组DNA；(2)、G6PD基因PCR扩增采用权利要求1所述引物序列；每个PCR扩增体系总体积为15μL，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、l0×PCR反应缓冲液、MgCl2)，去离子水5.5μL，引物(l0uM)0.5μL，基因组DNA(100ng/ul)1ul；PCR反应条件为94℃3分钟，进行14个循环的94℃30秒，62℃30秒，72℃40秒；然后...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅艳巧，陈培华，谢桂贞，郭岳，
申请(专利权)人：上海浦东解码生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31