一种核酸序列非依赖的全RNA扩增方法技术

本发明专利技术涉及一种核酸序列非依赖的全RNA扩增方法，首先在随机引物的5’端引入T7 RNA多聚酶启动子序列与固定序列用于合成RNA的互补cDNA，通过纯化去除多余引物后使用另一条5’端带有固定序列的随机引物合成第二链cDNA，再次通过纯化去除多余引物后获得两端带有不同固定序列的双链cDNA，其中一端具有T7 RNA多聚酶启动子序列，然后以固定序列为引物、T7 RNA多聚酶，AMV反转录酶和RNase H进行恒温转录反转录反应，实现对模板中全RNA的扩增。该方法可以对模板中所有RNA分子进行扩增，不依赖核酸序列信息，对于微量核酸特别是未知病原的靶标放大优势明显，有助于下游特定分子的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸序列非依赖的全RNA扩增方法
本专利技术涉及一种核酸序列非依赖的全核糖核酸(RNA)扩增方法，属于生物

技术介绍
核糖核酸(RNA)是一类重要的遗传信息载体，参与蛋白质合成、基因表达调控等过程，存在于生物细胞和部分病毒、类病毒。对RNA的定量、定性检测可用于评价机体生殖发育、细胞生理、代谢状态、疾病诊断等。目前，对RNA的检测一般是将RNA反转录成cDNA后，通过多聚酶链反应(PCR)方法进行检测。然而，由于细胞生理、病毒含量不同，存在RNA含量较低不能满足最低检测限的情况，此时需要对微量的RNA进行扩增后再进行检测。无论是前述的反转录PCR方法还是近年来发展的等温扩增方法如反转录环介导的等温扩增(LAMP)或反转录重组酶聚合酶扩增(RPA)等，均需要设计针对特定靶标的引物，且扩增产物均为靶标特定的脱氧核糖核酸(DNA)片段，存在扩增靶标单一，产物污染问题。而现有技术中用于RNA序列扩增的方法(申请号：200480038577.6)、依赖核酸序列的扩增(NASBA)和转录介导的扩增(TMA)方法尽管扩增产物为RNA，但还是存在需要预先知晓靶标序列，设计特异引物，只能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸序列非依赖的全RNA扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取RNA；(2)cDNA的制备：以步骤(1)的RNA为模板，以5’端含有T7RNA多聚酶启动子序列与固定序列的第一引物和AMV反转录酶进行反转录反应,获取RNA和cDNA杂合体，得到的cDNA的一端具有T7RNA多聚酶启动子序列与固定序列；其中，固定序列为长度为15‑30bp的核苷酸；所述第一引物的3’端含有随机碱基序列，随机碱基序列长度为6‑9bp；(3)单链cDNA的获取及纯化：以RNase H消化RNA和cDNA杂合体，获取单链cDNA，并纯化去除第一引物；(4)双链cDNA的制备：以另一条5’端带有固定序列、3...

【技术特征摘要】
1.一种核酸序列非依赖的全RNA扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取RNA；(2)cDNA的制备：以步骤(1)的RNA为模板，以5’端含有T7RNA多聚酶启动子序列与固定序列的第一引物和AMV反转录酶进行反转录反应,获取RNA和cDNA杂合体，得到的cDNA的一端具有T7RNA多聚酶启动子序列与固定序列；其中，固定序列为长度为15-30bp的核苷酸；所述第一引物的3’端含有随机碱基序列，随机碱基序列长度为6-9bp；(3)单链cDNA的获取及纯化：以RNaseH消化RNA和cDNA杂合体，获取单链cDNA，并纯化去除第一引物；(4)双链cDNA的制备：以另一条5’端带有固定序列、3’端带有随机碱基序列的第二引物和KlenowFragment(3′→5′exo–)生成两端均带有固定序列的双链cDNA，其一端具有T7RNA多聚酶启动子序列；其中，第二引物的固定序列为长度为15-30bp的核苷酸，随机碱基序列长度为6-9bp；(5)双链cDNA的纯化：双链cDNA经纯化去除第二引物；(6)SIIA等温扩增：具有T7RNA多聚酶启动子序列的双链cDNA在T7RNA多聚酶作用下合成大量反义RNA，反义...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，葛以跃，吴斌，吴涛，朱小娟，赵康辰，陈银，朱凤才，周明浩，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32