DNA序列的靶标特异性RNA转录方法技术

本文公开了使用直接从靶标合成的RNA中间体进行长距离靶标特异性扩增和测序以消除早期合成错误的克隆扩增的方法。方法允许鉴定靶标相邻序列，如与重复元件靶标相邻的序列。本文还公开了用于扩增和测序的组合物和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA序列的靶标特异性RNA转录方法相关申请本申请要求于2016年2月12日提交的美国临时申请序列号62/294,875的权益，该临时申请的内容通过引用以其全文并入于此。
技术介绍
本文的公开内容涉及分子生物学领域，如核酸样品中与重复序列相邻的核酸序列的扩增和鉴定。PCR或PCR技术的变型以及杂交捕获是靶向测序的主要方法。虽然广泛使用，但二者均对长读取测序仪具有限制。杂交捕获使用带有生物素的短RNA或DNA探针与靶DNA杂交并“拉下”感兴趣的序列。对于长靶序列，这种方法是低效的，这既是因为需要许多寡核苷酸探针，又是因为该过程往往导致在拉下过程中长DNA分子的物理剪切。这些缺陷限制了使用单分子技术的连续测序仪读取的长度。长距离PCR已被用作备选方案，但也提出了挑战。长距离PCR难以多路化(multiplex)。通常，由于在目标区域之外的相反链上需要相反的PCR引物，因而失去了检测大染色体事件如易位的能力。另外，PCR的克隆扩增限制了检测非均相样品如肿瘤中的低频率体细胞变异的灵敏度，并且可能从反应的早期循环开始传播聚合酶错误，如点突变或易位。此外，长距离PCR有时展现出模板转换，从而在扩增产物中产生错误。
技术实现思路
基因组测序技术的进步极大地增加了我们对人类遗传变异及其对疾病的贡献的理解。短读取DNA测序技术(Illumina，ThermoFisher，Qiagen)产生了数十亿个短读取，导致单核苷酸多态性以及小插入和缺失的常规鉴定。这些短读取测序技术未显示出检测更复杂变异的灵敏度，如大规模染色体重排、易位和可动元件重排。长读取测序技术(PacificBiosciences，OxfordNanopore)已显示出生成超过10,000个碱基对的单分子读取长度的能力，但没有测序和组装完整的人类基因组的能力。本文公开的靶向策略利用了这些更长的读取长度。在这里，我们描述了长距离靶标特异性扩增的方法，其中仅对原始模板进行扩增，以便相对于样品DNA序列产生原始靶序列的增加的拷贝。扩增的产物直接来源于样品模板，而不是来源于合成的扩增中间体或先前合成的样品模板的拷贝。因此，合成的拷贝不包含来自先前合成反应的错误。这显著降低了早期错误在反应过程中差异放大的可能性。因为合成产物不用作模板，所以合成中的任何错误均独立地导出，并且不可能从一个分子匹配至下一个分子。因此，通过比较所合成的产物，人们可以容易地识别合成中的错误，并且更容易地导出样品序列。所公开的主题在伴随本公开内容的权利要求列表中部分地进行了总结。本文提供了确定与核酸分子的已知序列的区域相邻的序列的方法。一些这样的方法包括a)将包含启动子序列的核酸片段附接至所述核酸分子的已知区域；b)使所述核酸片段与由所述启动子引导的RNA聚合酶接触；以及c)合成多个RNA分子；其中所述多个RNA分子的共有序列表示与核酸分子的所述已知区域相邻的序列。任选地，所述共有序列的长度至少为10千碱基。有时，该方法包括在合成所述多个RNA分子之后使用DNA酶处理所述核酸分子。备选地或组合地，该方法包括对所述多个RNA分子进行逆转录。该方法有时包括确定所述多个RNA分子的核酸序列。任选地，所述多个RNA分子的共有序列包含直接从所述核酸分子合成的分子的序列。备选地或组合地，所述附接包括将所述包含启动子序列的核酸片段插入所述核酸分子的已知区域。在一些情况下，所述附接包括将所述包含启动子序列的核酸片段插入所述核酸分子的已知序列的区域。任选地，所述附接包括所述核酸分子的已知序列区域的序列特异性切割。备选地或组合地，所述附接包括使所述核酸分子的已知区域与CRISPR核酸-蛋白质复合物接触。任选地，所述CRISPR核酸-蛋白质复合物包含含有SEQIDNO:3的指导RNA。在一些情况下，所述附接包括连接包含启动子序列的核酸片段。有时，所述包含启动子序列的核酸片段包含病毒启动子。任选地，所述病毒启动子结合病毒RNA聚合酶，并且为选自T7、T3、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40和CaMV35S的至少一种启动子。备选地或组合地，所述包含启动子序列的核酸片段包含细菌启动子。在一些情况下，所述细菌启动子结合细菌RNA聚合酶，并且为选自araBAD、trp、lac和Ptac的至少一种启动子。有时，所述包含启动子序列的核酸片段包含真核启动子。任选地，所述真核启动子结合真核RNA聚合酶，并且为选自EF1a、PGK1、Ubc、β肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体蛋白、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1和U6的至少一种启动子。备选地或组合地，所述真核启动子为选自RNApolI启动子、RNApolII启动子和RNApolIII启动子的至少一种启动子。任选地，所述核酸分子的已知区域包含重复元件。在一些情况下，所述重复元件包含可动插入元件。有时，所述重复元件包含LINE元件、SINE元件、Alu重复序列、转座子、反转录转座子、着丝粒重复序列和端粒重复序列中的至少一种。备选地或组合地，所述LINE元件包含SEQIDNO:1。在另外的实施方案中，提供了确定核酸样品中元件的多个基因座相邻序列的方法，该方法包括以下步骤：a)将包含启动子的核酸插入所述元件中，b)生成由所述启动子引导的多个核酸分子，以及c)确定所述多个核酸分子的序列，其中所述核酸分子直接从所述核酸样品合成，并且其中所述多个核酸分子跨越基因座相邻序列。任选地，所述核酸分子包含RNA。在一些情况下，所述核酸分子不能引发核酸合成。有时，所述核酸样品包含癌细胞核酸。在一些情况下，所述核酸样品包含单个核基因组。通常，所述核酸样品获自单个细胞。任选地，该方法包括在合成所述多个RNA分子之后使用DNA酶处理所述核酸样品。有时，该方法包括对所述多个RNA分子进行逆转录。在一些情况下，所述多个核酸分子为RNA分子。有时，所述多个RNA分子的共有序列包含直接从所述核酸分子合成的分子的序列。在一些情况下，所述附接包括将所述包含启动子序列的核酸片段插入所述核酸分子的已知区域。任选地，所述附接包括将所述包含启动子序列的核酸片段插入所述核酸分子的已知区域。有时，所述附接包括所述核酸分子的已知区域的序列特异性切割。任选地，所述附接包括使所述核酸分子的已知区域与CRISPR核酸-蛋白质复合物接触。在一些情况下，所述CRISPR核酸-蛋白质复合物包含含有SEQIDNO:3的指导RNA。有时，所述附接包括连接所述包含启动子序列的核酸片段。在一些情况下，所述包含启动子序列的核酸片段包含病毒启动子。病毒启动子为不同地选自T7、T3、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40和CaMV35S的至少一种启动子。有时，所述包含启动子序列的核酸片段包含细菌启动子。任选地，所述细菌启动子为选自araBAD、trp、lac和Ptac的至少一种启动子。在一些情况下，所述包含启动子序列的核酸片段包含真核启动子。例如，有时，所述真核启动子为选自EF1a、PGK1、Ubc、β肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体蛋白、CaMKIIa、ALB、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1和U6的至少一种启动子。任选地，所述真核启本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种确定与感兴趣的核酸序列相邻的核酸序列的方法，其包括：(a)将包含靶向序列和启动子的靶向核酸序列插入所述感兴趣的核酸序列中的一个或多个特定位置，(b)指导从所述启动子合成核酸，以及(c)对所合成的核酸进行测序。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.12 US 62/294,8751.一种确定与感兴趣的核酸序列相邻的核酸序列的方法，其包括：(a)将包含靶向序列和启动子的靶向核酸序列插入所述感兴趣的核酸序列中的一个或多个特定位置，(b)指导从所述启动子合成核酸，以及(c)对所合成的核酸进行测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向序列包含成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)序列、锌指核酸酶(ZFN)序列和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)序列中的至少一种。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述CRISPR序列包含具有包含SEQIDNO:3的序列的指导RNA。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述启动子包含细菌启动子、病毒启动子和真核启动子中的至少一种。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细菌启动子包含araBAD、trp、lac和Ptac中的至少一种。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述病毒启动子包含T7、T7lac、SP6、pL、CMV、SV40和CaMV35S中的至少一种。7.根据权利要求4所述的方法，其中真核启动子包含EF1a、PGK1、Ubc、β肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体蛋白、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、Ubi、H1和U6中的至少一种。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的序列包含低复杂性核酸序列。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的序列包含重复核酸序列。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的序列包含三核苷酸重复序列、串联重复序列和人白细胞抗原基因中的至少一种。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的序列包含可动遗传元件。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述可动遗传元件包含转座子、反转录转座子、DNA转座子、插入序列、质粒、噬菌体、II组内含子、I组内含子、Alu元件、MIR元件、内质网池内A粒子(IAP)、ETn、病毒或其片段。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述反转录转座子包含转座因子、LINE、SINE及其片段中的至少一种。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：基斯·布朗，
申请(专利权)人：嘉普科德基因组学公司，
类型：发明
国别省市：美国,US