一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法技术

本发明专利技术公开了一种淫羊藿ISSR‑PCR分子标记方法，采用引物及ISSR‑PCR反应体系对提取的淫羊藿嫩叶的DNA样品进行扩增即可完成。本发明专利技术利用引物及优化后的ISSR‑PCR反应体系对淫羊藿的DNA进行ISSR‑PCR扩增，该方法准确可靠、操作简单、节约时间和成本，扩增条带清晰稳定，多态性好，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育等方面具有较好的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法
本专利技术属于分子标记
，具体地说，涉及一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法。
技术介绍
淫羊藿属(EpimediumL.)植物是小檗科(Berberidaceae)多年生草本药用植物，具有补肾强身，强筋健骨、祛风湿等功效，是我国传统中药材之一。我国是淫羊藿最主要的分布区，淫羊藿属植物约占世界总数的80％，在甘肃、贵州、湖南、湖北等地均有分布。研究表明，不同产地淫羊藿的活性成分、形态、质量差异较大，且不同居群的淫羊藿生物学特征也存在明显差异，这表明淫羊藿资源生物多样性丰富。目前。关于淫羊藿的研究主要集中在其活性成分、分类、抗逆性、光合生理、物候特征等方面，而缺乏关于其遗传变异的研究。分子标记技术能从DNA水平上反映物种的遗传差异，是研究遗传多样性的有效方法。近年来，ISSR分子标记技术因其操作简单、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定等。但ISSR标记是一种随机性标记方法，不同物种甚至同一物种不同条件下其试验参数均有差异，因此建立一个科学合理的ISSR-PCR反应体系，探寻最佳的PCR各组分的用量，可为后续开展淫羊藿的遗传多样性研究及良种选育等工作提供理论依据。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有针对淫羊藿的研究缺乏关于其遗传变异研究的问题，提供了一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，具体包括以下步骤：步骤1，采集淫羊藿的嫩叶，提取植物组DNA；步骤2，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；步骤3，采用引物及ISSR-PCR反应体系对步骤1提取的DNA样品进行扩增。进一步地，步骤3中ISSR-PCR反应体系为：20μL的反应体系中含有2×TaqMasterMix9.8μL，模板DNA30ng，引物0.325μM。进一步地，步骤3中ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。进一步地，步骤3中引物为：UBC808，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1；或UBC814，其核苷酸序列为：SEQIDNO.2；或UBC826，其核苷酸序列为：SEQIDNO.3；或UBC827，其核苷酸序列为：SEQIDNO.4；或UBC840，其核苷酸序列为：SEQIDNO.5；或UBC846，其核苷酸序列为：SEQIDNO.6；或UBC856，其核苷酸序列为：SEQIDNO.7。进一步地，步骤3中引物在ISSR-PCR扩增中优化后的退火温度，具体如下：UBC80860.3℃；UBC81446.8℃；UBC82660.3℃；UBC82765℃；UBC84052.4℃；UBC84654.3℃；UBC85654.3℃。本专利技术还提供了一种引物，所述引物用于标记淫羊藿ISSR-PCR分子，所述引物为：UBC808，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1；或UBC814，其核苷酸序列为：SEQIDNO.2；或UBC826，其核苷酸序列为：SEQIDNO.3；或UBC827，其核苷酸序列为：SEQIDNO.4；或UBC840，其核苷酸序列为：SEQIDNO.5；或UBC846，其核苷酸序列为：SEQIDNO.6；或UBC856，其核苷酸序列为：SEQIDNO.7。进一步地，所述引物在ISSR-PCR扩增中优化后的退火温度，具体如下：UBC80860.3℃；UBC81446.8℃；UBC82660.3℃；UBC82765℃；UBC84052.4℃；UBC84654.3℃；UBC85654.3℃。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术利用引物及优化后的ISSR-PCR反应体系对淫羊藿的DNA进行ISSR-PCR扩增，该方法准确可靠、操作简单、节约时间和成本，扩增条带清晰稳定，多态性好，对淫羊藿的遗传多样性分析、鉴定及良种选育等方面具有较好的应用价值。2)本专利技术提供一种淫羊藿的ISSR-PCR分子标记用引物，并在该引物的基础上建立并优化了淫羊藿的ISSR-PCR分子标记体系，根据结果显示，该体系扩增的条带清晰稳定，具有较好的多态性特点，操作步骤较少，易于快速分析检测。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为本专利技术ISSR-PCR均匀设计试验的扩增结果；其中M表示：marker；引物为UBC840；1-12为表2的处理组合1-12；图2为本专利技术2×TaqMasterMix作为单因素的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-7为表3中的处理组合1-7；图3为本专利技术2×TaqMasterMix微调的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-12为表4中的处理组合1-12；图4为本专利技术引物作为单因素的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-7为表5中的处理组合1-7；图5为本专利技术引物微调的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-9为表6中的处理组合1-9；图6为本专利技术DNA作为单因素的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-7为表7中的处理组合1-7；图7为引物UBC840最佳退火温度的确定；M表示：marker；引物为UBC840；从左到右温度依次为：45℃、46.4℃、48.8℃、52.4℃、57.2℃、61.0℃、63.5℃、65℃；图8为13个淫羊藿样本验证优化后反应体系的ISSR-PCR扩增结果；M表示：marker；引物为UBC840；1-13为13个淫羊藿样品ISSR-PCR产物的电泳条带。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1ISSR-PCR扩增体系的建立与优化1、DNA的提取将研钵用清水洗净晾干，加入5ml的无水乙醇后点燃，待研钵晾凉后，取采集到的淫羊藿嫩芽500mg于研钵中，倒入适量液氮，以液氮没过样品2～3cm高度为宜，研磨3～5min，然后采用试剂盒法提取石斛基因组DNA。2、ISSR-PCR扩增体系的建立1)ISSR-PCR反应体系的均匀设计试验方案采用U12(43)均匀设计表，PCR扩增体系的因素水平见表1。以UBC840为引物，淫羊藿DNA为模板，利用表2中的12个反应体系对ISSR-PCR进行优化筛选，反应体系为20μL，具体见表2。所述的ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，52.4℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。表1因素水平表(单位：μl)表2均匀设计试验表U12(43)/单位：μl结果如图1所示，除7、9、11、12以外，其他处理均有扩增条带。其中处理1、2、3、8、10扩增条带明亮清晰，且条带数多，为较为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淫羊藿ISSR‑PCR分子标记方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，采集淫羊藿的嫩叶，提取植物组DNA；步骤2，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；步骤3，采用引物及ISSR‑PCR反应体系对步骤1提取的DNA样品进行扩增。

【技术特征摘要】
1.一种淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1，采集淫羊藿的嫩叶，提取植物组DNA；步骤2，采用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性；步骤3，采用引物及ISSR-PCR反应体系对步骤1提取的DNA样品进行扩增。2.如权利要求1所述的淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，其特征在于，步骤3中ISSR-PCR反应体系为：20μL的反应体系中含有2×TaqMasterMix9.8μL，模板DNA30ng，引物0.325μM。3.如权利要求1或2所述的淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，其特征在于，步骤3中ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性4min，94℃变性1min，46.8～65℃退火40s，72℃延伸40s，循环40次，72℃再延伸5min，4℃保存。4.如权利要求3所述的淫羊藿ISSR-PCR分子标记方法，其特征在于，步骤3中引物为：UBC808，其核苷酸序列为：SEQIDNO.1；或UBC814，其核苷酸序列为：SEQIDNO.2；或UBC826，其核苷酸序列为：SEQIDNO.3；或UBC827，其核苷酸序列为：SEQIDNO.4；或UBC840，其核苷酸序列为：SEQIDNO.5；或UBC846，其核苷酸序列为：S...

【专利技术属性】
技术研发人员：段媛媛，郭杰，游景茂，周武先，郭晓亮，卢超，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院中药材研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42