一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法及应用技术

本发明专利技术属于蔬菜检测技术领域，公开了一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法及应用,提取青花菜基因组DNA；根据公布的4对引物序列，并对其进行编号；确定PCR扩增的体系、成分及反应程序；对扩增引物进行检测；鉴定杂交种“台绿5号”的纯度。本发明专利技术使用4对SSR引物同时鉴定青花菜‘台绿5号’杂交种纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度达100％，结果可靠；鉴定在10天以内即可完成，避免田间种植鉴定的繁琐程序，节约劳动力和土地资源，鉴定成本低；在制种当年确定种子遗传纯度，便于种子定级与收购，提高鉴定效率；对DNA提取、凝胶电泳等实验操作都做相应的简化，更适合对大规模批量样本进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法及应用
本专利技术属于蔬菜检测
，尤其涉及一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法及应用。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)，又名绿花菜、西兰花等，是十字花科芸薹属甘蓝种的一个变种。其食用部分是带有花蕾群的肥嫩花茎，营养丰富，风味独特，而且具有抗癌和抗氧化功效，深受广大消费者的喜爱。近年来我国青花菜栽培面积逐年增加，对优势青花菜品种的需求也不断加大，利用杂种优势生产青花菜F1杂交种已经成为一种趋势。但是，在杂交种制种过程中母本自交，人们操作过程的相互传粉，鸟类、蜜蜂等造成的串粉都会形成假杂种，再加上青花菜杂交种种粒小且品种之间差异小，在收获、脱粒、加工、贮藏、包装、销售的过程中也容易造成混杂。目前育种者主要依靠常规大田种植对青花菜杂交种纯度进行鉴定，但其周期长且费工、占地，易受季节限制，对当年生产的杂交种纯度难以确定，对因环境条件影响所引起的变异与本品种遗传所产生的变异区分较困难，不适应当前生产的需要。植物品种之间的差异归根结底是基因的差异，利用现代分子生物学手段从遗传基础上检测杂交种的纯度更加符合市场需求。利用分子标记进行DNA指纹鉴定直接检测品种间DNA水平上的差异，不受环境影响和季节限制，测试周期短、准确率高，已经被广泛应用于种子的纯度鉴定。其中SSR(SimpleSequenceRepeats)标记具有数量丰富、分布均匀、操作方便、共显性遗传、稳定性好等有优点，是进行杂交种纯度鉴定的理想标记类型。目前，研究者已经利用SSR和EST-SSR标记进行了水稻、西瓜、黄瓜等多种作物的杂交种纯度鉴定，但在青花菜杂交种遗传纯度鉴定研究较少，而且通过多对引物标记进行同时鉴定则更少。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有的大田种植对青花菜杂交种纯度进行鉴定，周期长且费工、占地，易受季节限制；(2)现有的青花菜杂交种纯度的检测方法对当年生产的杂交种纯度难以确定。(3)青花菜纯度鉴定大多数只通过1对引物来做种子纯度的鉴定，准确率低，与其他品种容易混肴，从而造成损失。解决上述技术问题的意义：(1)能够快速的进行种子纯度的鉴定，为农户种植“台绿5号”得到了可靠的品种保障；(2)通过多对引物同时鉴定种子纯度，准确率高，能更好的区分其它品种的混入，同时也保证了亲本的纯度。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法及应用，本专利技术是这样实现的，一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法，所述的青花菜杂交种纯度的快速检测方法：步骤一：采用CTAB简易提取法，快速提取青花菜基因组DNA；步骤二：根据文献上公布的引物，从中筛选到具有多态性的3对SSR和1对EST-SSR引物，并对其进行编号；步骤三：确定PCR扩增的体系、成分及反应程序；步骤四：对扩增引物进行检测，在扩增产物中加入2μL的loadingBuffer混匀，取混合物在双垂直板浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶经染色和显色液显色后照相；步骤五：通过被鉴定样品在凝胶上的条带特征来鉴定杂交种的纯度。进一步，所述步骤一中，采用CTAB简易提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA，具体步骤包括：①苗期取幼嫩叶片0.2g，剪成小块，装入2mL离心管中，同时每只离心管加入1粒不锈钢钢珠，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置10min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5min；②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入600μL2％CTAB裂解液，65℃水浴30min；③加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇晃数次，12000rpm离心10min；④取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，-20℃冰箱静置120min，12000rpm离心10min；⑤弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤两次，干燥后加入ddH2O-20℃保存备用。进一步，所述步骤二中，4对引物编号及序列分别为:SSR6：上游引物5'-CGAACATCTTAGGCCGAATC-3'；下游引物5'-GGTTAACCTGCGGGATATTG-3'；BoE225：上游引物5'-ATCTGATGTGGAGCCTGTTGTT-3'；下游引物5'-CCTTACGATCTGGGAGTGAAAA-3'；CB10028：上游引物5'-CTGCACATTTGAAATTGGTC-3'；下游引物5'-AAATCAACGCTTACCCACT-3'；CB10526：上游引物5'-TTCTTCTTTCCACCACCA-3'；下游引物5'-ACTCGGCGGTTAGAGAAT-3'。进一步，所述步骤三中，PCR扩增反应总体系为10μL，体系成分为：基因组DNA8ng，10μM上下游引物分别0.2μL，10mMdNTP0.2μL，5U·μL-1TaqDNA聚合酶0.15μL，10×buffer(含Mg2+)1μL，无菌重蒸水补齐至7.45μL。进一步，所述步骤三中，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性0.5min，55℃退火0.5min，72℃延伸0.5min，31个循环，72℃延伸5min，4℃保存。进一步，所述步骤四中，扩增产物中加入2μL的loadingBuffer混匀，之后取2.5μL混合物在浓度为8％的双垂直板非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，在恒定电压220V下电泳70min，，凝胶经AgNO3染色和显色液显色后照相。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述青花菜杂交种纯度的快速检测方法在其他蔬菜杂交种纯度的检测上的应用，所述蔬菜杂交种纯度的检测上的应用的方法包括：采用CTAB简易提取法，快速提取蔬菜基因组DNA；根据文献上公布的引物，从中筛选到具有多态性的3对SSR和1对EST-SSR引物，并对其进行编号；确定PCR扩增的体系、成分及反应程序；对扩增引物进行检测，在扩增产物中加入2μL的loadingBuffer混匀，取混合物在双垂直板浓度为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶经染色和显色液显色后照相；通过被鉴定样品在凝胶上的条带特征来鉴定杂交种的纯度。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：(1)本专利技术使用的3对SSR引物SSR6、CB10526、CB10028和1对EST-SSR引物BoE225同时鉴定青花菜‘台绿5号’杂交种纯度的准确性高，与田间鉴定结果相符度达100％，结果可靠；(2)可以明确区分和判别青花菜的不同品种，鉴定在10天以内即可完成，避免了田间种植鉴定的繁琐程序，节约了劳动力和土地资源，鉴定成本降低。因此能在制种当年确定种子遗传纯度，便于种子定级与收购，提高了鉴定效率；(3)青花菜的性状易受环境的影响，田间鉴定有时比较困难，而本专利技术无需田间进行，不受环境影响，在室内即可进行；(4)通过4对引物进行青花菜种子纯度的鉴定相对于现有的1对引物进行纯度鉴定，鉴定结果更精确、更可靠；(5)试验鉴定使用了205份样品进行纯度检测，鉴定群体大。另外现有的技术中田间验证则做的很少，本试验则通过田间的一对一的验证，因此对应的引物标记更加精确可靠。本专利技术对DNA提取、凝胶电泳等实验操作都做相应的简化，更适合对大规模批量样本进行检测。经试验证明，利用常规田间鉴定方法，205份待本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法，其特征在于，所述的青花菜杂交种纯度的快速检测方法：步骤一：采用CTAB简易提取法，快速提取青花菜基因组DNA；步骤二：根据公布的引物，从中筛选到具有多态性的3对SSR和1对EST‑SSR引物，并进行编号；步骤三：确定PCR扩增的体系、成分及反应程序；步骤四：对扩增引物进行检测，在扩增产物中加入2μL的loading Buffer混匀，取混合物在双垂直板浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶经染色和显色液显色后照相；步骤五：通过被鉴定样品在凝胶上的条带特征来鉴定杂交种的纯度。

【技术特征摘要】
1.一种青花菜杂交种纯度的快速检测方法，其特征在于，所述的青花菜杂交种纯度的快速检测方法：步骤一：采用CTAB简易提取法，快速提取青花菜基因组DNA；步骤二：根据公布的引物，从中筛选到具有多态性的3对SSR和1对EST-SSR引物，并进行编号；步骤三：确定PCR扩增的体系、成分及反应程序；步骤四：对扩增引物进行检测，在扩增产物中加入2μL的loadingBuffer混匀，取混合物在双垂直板浓度为8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，凝胶经染色和显色液显色后照相；步骤五：通过被鉴定样品在凝胶上的条带特征来鉴定杂交种的纯度。2.如权利要求1所述的青花菜杂交种纯度的快速检测方法，其特征在于，所述步骤一中，采用CTAB简易提取法快速提取青花菜幼苗基因组DNA，具体步骤包括：①苗期取幼嫩叶片0.2g，剪成小块，装入2mL离心管中，同时每只离心管加入1粒不锈钢钢珠，盖好离心管盖后放入装有液氮的泡沫盒中静置10min，倒出液氮，快速用力摇晃泡沫盒5min；②打开离心管盖倒出钢珠，向离心管中加入600μL2％CTAB裂解液，65℃水浴30min；③加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇晃数次，12000rpm离心10min；④取上清，加入2/3体积预冷异丙醇，混匀，-20℃冰箱静置120min，12000rpm离心10min；⑤弃上清，沉淀出的DNA用70％乙醇洗涤两次，干燥后加入ddH2O-20℃保存备用。3.如权利要求1所述的青花菜杂交种纯度的快速检测方法，其特征在于，所述步骤二中，4对引物编号及序列分别为:SSR6：上游引物5'-CGAACATCTTAGGCCGAATC-3'；下游引物5'-GGTTAACCTGCGGGATATTG-3'；BoE225：上游引物5'-ATCTGATGTGGAGCCTGTTGTT-3'；下游引物5'-CCTTACGATCTGGGAGTGAAAA-3'；CB10028：上游引物5'-...

【专利技术属性】
技术研发人员：高旭，何道根，朱长志，檀国印，
申请(专利权)人：台州市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：浙江,33