一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用，本发明专利技术公开的比率型近红外荧光探针利用单磷酸酯(也是ALP识别基团)保护NIR荧光团的羟基，当向体系中加入碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶可通过酶促反应诱导单磷酸酯基团断裂释放，该反应导致溶液颜色发生显著变化，发光由近红外区转变为红色发光。通过紫外‑可见吸收光谱法和荧光光谱法等研究了其对多种酶的识别效果，结果表明这种比率荧光探针在Tris‑HCl缓冲溶液中能够高效选择性识别碱性磷酸酶，且对碱性磷酸酶具有很高的响应灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用
本专利技术属于小分子荧光探针领域，涉及一种用于检测细胞内源性碱性磷酸酶的方法策略。更具体地，涉及一种比率型近红外荧光探针及其合成方法和它在检测碱性磷酸酶中的应用。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是一种重要的水解酶，可催化核酸、蛋白质和一些小分子的脱磷酸过程，由于血清中ALP含量的异常与前列腺癌、骨病、肝功能障碍和糖尿病等几种疾病密切相关，其活性通常被认为是医学诊断中的重要生物标志物。因此，对ALP高效便捷的检测可为疾病的诊断提供可靠、有效的数值依据。现今对ALP的检测主要依赖比色法、色谱法、电化学发光法和荧光测定法等手段，这些方法大多对仪器设备的要求较高，且无法快速提供实时检测结果。对比之下，具有高灵敏度、高选择性的荧光测定法可用于裸眼定位目标待测物，在生命科学和环境检测等领域更具发展潜力。近红外荧光探针采用近红外光谱分析，在生物体内分子的诊断识别中起着关键的作用。因为近红外波段(600～800nm)的光波避开了体内水、有氧及无氧血红蛋白等主要吸收组织的最佳吸收波长，从而具有良好的生物组织穿透能力，能降低对生物组织的损伤。并且该类染料的类型比较多，摩尔消光系数高，具有良好的水溶性，分子量比较小(一般小于1000)，可以避免对被标记分子的连接与功能产生空间位阻效应。另外，现今对碱性磷酸酶的检测主要依赖色谱法、电化学发光法、电化学法、表面增强共振拉曼散射方法、比色法和荧光法等手段，上述方法大多需要复杂的仪器，限制了其实际应用。在诸多方法中，光谱分析手段具有较高的灵敏度和选择性，对仪器设备的门槛要求较低，并有较为广阔的商用价值，是目前具有应用价值的碱性磷酸酶分析方法。因此，如何提供一种高灵敏度、高选择性的近红外荧光探针是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种比率型近红外荧光探针及其合成方法与应用。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种比率型近红外荧光探针，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：所述比率型近红外荧光探针利用单磷酸酯(也是ALP识别基团)保护NIR荧光团的羟基，当向体系中加入碱性磷酸酶时，碱性磷酸酶可通过酶促反应诱导单磷酸酯基团断裂释放，该反应导致溶液颜色发生显著变化，发光由近红外区转变为红色发光。本专利技术可以通过肉眼对目标物碱性磷酸酶进行可视化鉴别，也可进入活细胞中对细胞内源性碱性磷酸酶进行测定。本专利技术的另一目的是提供一种比率型近红外荧光探针的合成方法。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种比率型近红外荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇通过分水分流法得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150°С，反应时间为10～12h，(2)在N2气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85°С～95℃，纯化得到化合物2，(3)将上述化合物2溶于干燥的二氯甲烷中，滴入三氯氧磷，室温反应2.5～3.5h，冰水水解，用二氯甲烷萃取得到本专利技术的比率型近红外荧光探针，通过采用上述技术方案，本专利技术的作用原理如下：本专利技术近红外荧光探针以花菁为荧光基团，在Tris-HCl缓冲溶液中可通过与ALP的酶促反应诱导其单磷酸酯基团的断裂及离去，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处吸收强度的比值(A516nm/A736nm)和荧光强度的比值(F616nm/F766nm)变化可检测ALP的存在与否。在没有加入ALP时，所述探针的最大吸收和荧光发射波长均处在近红外区，分别为736nm和766nm；加入ALP后，736nm处的吸收减弱，766nm处的荧光减弱，最大吸收波长和荧光发射波长分别蓝移至516nm和616nm。并且，该合成方法不仅操作简单，而且产率高，提纯方便快捷。优选的，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为(1～3):1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为(6～8):(2～4)；优选吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇的摩尔比为2:1，所用溶剂正丁醇/苯的体积比为7:3。优选的，所述步骤(2)中，化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:(2～4)，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺的体积为5～7mL；优选化合物1与乙酸钠的摩尔比为1:3，所用溶剂N,N-二甲基甲酰胺为6mL。优选的，所述步骤(3)中，化合物2和三氯氧磷的摩尔比为1:(8～10)，所用无水二氯甲烷的体积为5～7mL；优选化合物2和三氯氧磷的摩尔比为1:10，无水二氯甲烷为5mL。原料配比不会影响产物对碱性磷酸酶的检测性能，优化原料配比仅为提高反应产率。如加入10倍量的三氯氧磷以使化合物2充分反应生成所需产物，若三氯氧磷加入较少则化合物2会有剩余，则给后续纯化过程带来一定难处。另外，专利技术人分别通过核磁共振氢谱、碳谱、磷谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述比率型近红外荧光探针合成成功。本专利技术还有一个目的，就是提供比率型近红外荧光探针在检测碱性磷酸酶中的具体应用。优选的，所述碱性磷酸酶在癌细胞中过渡表达，合成的荧光探针可进入活细胞对细胞内源性碱性磷酸酶进行检测。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种比率型近红外荧光探针的合成方法及其检测细胞内源性碱性磷酸酶的应用。本专利技术近红外荧光探针合成方法不仅操作简便，生物毒性低，而且在Tris-HCl缓冲溶液中能够高效选择性识别ALP；同时通过对细胞初步标记研究表明，该探针具有很好的线粒体共定位效果，能够对ALP具有较高的灵敏度，少量的探针即可对细胞内ALP作出快速响应。本专利技术所公开的用于检测ALP的方法策略具有市场应用与推广价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振氢谱。图2附图为本专利技术比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振碳谱。图3附图为本专利技术比率型近红外荧光探针在二甲基亚砜中的核磁共振磷谱。图4附图为本专利技术比率型近红外荧光探针在Tris-HCl缓冲溶液中与ALP相互作用时的紫外可见光谱图。图5附图为相对吸光度值A516nm/A736nm与ALP活性的线性响应曲线。图6附图为荧光比率F616nm/F766nm与ALP活性的线性响应曲线。图7附图为近红外荧光探针与MitoTrackerGreen(购买的线粒体示踪剂)细胞内共定位共聚焦图像。图8附图为近红外荧光探针在细胞内成像的共聚焦时间跟踪。图9附图为近红外荧光探针分别在癌细胞和正常细胞内的共聚焦成像。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种高灵敏度的测定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种比率型近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：

【技术特征摘要】
1.一种比率型近红外荧光探针，其特征在于，所述近红外荧光探针具有花菁荧光基团，其结构式为：2.一种比率型近红外荧光探针的合成方法，具体包括如下步骤：(1)吲哚季铵盐和(2-氯-3-(羟甲基)环己基)甲醇通过分水分流法得到化合物1，其中反应体系温度为130℃～150℃，反应时间为10～12h，(2)在N2气氛下将上述化合物1与乙酸钠在N,N-二甲基甲酰胺溶剂中反应5～7h，反应温度为85℃～95℃，纯化得到化合物2，(3)将上述化合物2溶于干燥的二氯甲烷中，滴入三氯氧磷，室温反应2.5～3.5h，冰水水解，并用二氯甲烷萃取得到本发明的比率型近红外荧光探针。3.根据权利要求2所述的一种比率型近红外荧光探针的合成方法，其特征在于，所述步骤(1)中，吲哚季铵盐...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏，李沙沙，张倩，傅彩霞，丁彩凤，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东,37