纯化胶原7的方法技术

本公开提供了用于从细胞培养物中捕获重组胶原7的方法，以及纯化重组胶原7的方法。还提供了包含纯化的重组胶原7的组合物，其可用于施用至人。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】纯化胶原7的方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月16日提交的美国临时专利申请号62/309,030的权益，并且依赖于其提交日期，其全部公开内容通过引用并入本文。
本公开涉及捕获和纯化胶原7的方法和包含纯化的胶原7的组合物，包括可施用至人的纯化的胶原7。
技术介绍
胶原7(“C7”)是结构蛋白，其用于增强和稳定皮肤，并且是固着性原纤维的主要组分，其帮助将皮肤的顶层(表皮)锚定到下面的真皮。C7单体组装成约900kDa的同源三聚体，其含有一个NC-1和一个NC-2结合结构域。同源三聚体通过α螺旋卷曲保持在一起。同源三聚体中，这些C7蛋白前体排列成反平行二聚体，分子量增加至1.8mDa。反平行二聚体的侧向组装导致固着性原纤维的形成(约800nm长)。大疱性表皮松解症(EB)是一类遗传病症，其导致皮肤非常脆弱并且容易起疱。对轻微的损伤或摩擦(例如摩或刮)反应而产生疱和皮肤糜烂。营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)是大疱性表皮松解症的主要形式之一。这种病症的体征和症状在受影响的个体中差异很大。在轻微的情况下，疱可能主要影响手、脚、膝和肘。这种病症的严重情况涉及广泛的疱，可导致视力丧失、毁容和其它严重的医疗问题。营养不良性大疱性表皮松解症可分为三大类：隐性营养不良性大疱性表皮松解症(RDEB)、非Hallopeau-Siemens型(非HSRDEB)和常染色体显性遗传型(DDEB)。虽然这些类型的严重程度不同，但它们的特征显著重叠，它们都是由COL7A1基因突变引起的，该基因编码蛋白胶原7。还可以通过使用胃蛋白酶溶解羊膜来纯化C7同源三聚体[2]。通过差异盐沉淀部分分级溶解的胶原，其中C7与胶原5(“C5”)共沉淀。在通过DEA-纤维素色谱法去除污染的蛋白聚糖后，可以通过CM-纤维素色谱法从C5中分离C7。该产品纯度足以供常规实验室使用。如果需要进一步纯化，可以通过制备型速度沉降获得纯天然结构。在HPLC反相色谱后可以获得纯的变性α链。通过用硫酸铵沉淀然后进行阴离子交换色谱法，在实验室规模上纯化rC7[2]。然而，该纯化方法的产率和纯度不足以用于治疗目的的rC7的商业规模纯化。先前尝试开发rC7的商业规模纯化方法具有仅约1％的总产率。
技术实现思路
本公开提供了制备纯化的rC7的方法。与先前的方法相比，这些纯化方法显著提高了rC7的产率，并且可用于制备可用于向人施用的高纯度商业规模的rC7组合物。一方面，本公开涉及用于从细胞培养上清液收集rC7并浓缩为未纯化大量液体的捕获方法，液体任选是冷冻的(“上游加工”)。另一方面，本公开涉及在未纯化的大量液体中纯化rC7的方法(“下游加工”)。还可以组合上游和下游加工步骤以获得适于施用至人的纯化胶原7。在某些实施方案中，捕获和纯化方法是商业规模的方法。上游加工包含澄清步骤(例如，深度过滤器)和浓缩/缓冲液交换步骤。对于上游加工，一个实施方案涉及捕获由细胞培养物生产的重组人胶原7的方法，该方法包括：a)使从细胞培养物中收获的上清液接触深度过滤器，其中所述上清液含有重组人胶原7；b)收集流过所述深度过滤器的溶液；c)将来自步骤b)的所述溶液进行超滤步骤，其中所述重组人胶原7浓缩于与超滤膜相邻的层中；d)丢弃第一截留物，其中所述第一截留物包含步骤(b)所述溶液中含有的杂质；e)使与超滤膜相邻的层接触增溶剂和/或表面活性剂以回收重组人胶原7，并获得含有重组人胶原7的第二截留物；f)使所述第二截留物进行渗滤步骤以获得包含重组人胶原7的未纯化的大量液体；以及g)任选地，冷冻所述未纯化的大量液体。在某些实施方案中，该方法在步骤a)之前还包括步骤：a)培养生产重组人胶原7的宿主细胞；以及b)从培养的宿主细胞中收获上清液。在某些实施方案中，未纯化的大量液体在澄清的上清液中含有40-80％的重组胶原7。在一个实施方案中，未纯化的大量液体在澄清的上清液中平均含有约60％的重组胶原7。在某些实施方案中，细胞培养包括在生物反应器中培养宿主细胞，其体积为至少200升，优选至少1500升。在某些实施方案中，生物反应器是灌注生物反应器或补料分批生物反应器。在某些实施方案中，未纯化的大量液体含有超过50克的重组人胶原7。在某些实施方案中，增溶剂包括尿素、硫脲、精氨酸、丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、乙酸镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和胍中的至少一种。在一个实施方案中，增溶剂包含精氨酸。对于下游加工，一个实施方案涉及纯化重组人胶原7的方法，该方法包括：a)使含有重组人胶原7的样品接触混合模式流过树脂，其中所述混合模式流过树脂包括配体活化核和非活性壳，其中所述非活性壳防止重组人胶原7进入配体活化核，并且其中足够小的杂质通过非活性壳并与配体活化核结合；b)收集流过混合模式流过树脂的且含有重组人胶原7的第一流出物(effluent)；c)在允许所述重组人胶原7与阳离子交换色谱树脂结合的条件下，使来自步骤b)的所述第一流出物接触阳离子交换色谱树脂；d)从阳离子交换色谱树脂中洗脱重组人胶原7；e)使步骤d)洗脱的重组人胶原7接触流过模式的疏水相互作用色谱树脂，并收集流过疏水相互作用色谱树脂的第二流出物；f)使步骤e)的第二流出物进行超滤步骤以浓缩重组人胶原7；g)用缓冲液对来自步骤f)的浓缩的重组人胶原7进行渗滤；以及h)回收纯化的重组人胶原7，其中该方法包括一个或多个病毒减少步骤和内切核酸酶处理步骤。在某些实施方案中，超滤步骤包括切向流过滤器，并且其中切向流过滤器包括亲水膜。在某些实施方案中，该方法在步骤f)之前还包括将增溶剂和/或表面活性剂添加到来自步骤e)的第二流出物中的步骤。在某些实施方案中，所述一个或多个病毒减少步骤在步骤a)之前包括辐射(例如，UV辐射)含有重组人胶原7的样品的步骤，向来自步骤b)的第一流出物添加表面活性剂的步骤，以及将来自步骤e)的第二流出物接触多孔过滤器的步骤。在一个实施方案中，多孔过滤器包含多个平均直径为35nm的孔。在某些实施方案中，内切核酸酶处理步骤包括用内切核酸酶处理来自步骤d)的洗脱的重组人胶原7。在某些实施方案中，缓冲液包含至少一种盐、增溶剂和糖。在某些实施方案中，所述至少一种盐是氯化钠、柠檬酸盐和磷酸钠中的一种或多种，所述增溶剂是精氨酸，并且所述糖是蔗糖。在某些实施方案中，步骤h)的纯化重组人胶原7含有平均15-30％的来自步骤a)样品中的重组人胶原7的量。在某些实施方案中，步骤a)中的样品含有至少25克重组人胶原7。在某些实施方案中，在步骤h)中回收至少4.0克纯化的重组人胶原7。在某些实施方案中，步骤h)的纯化重组人胶原7含有不超过2000ng的宿主细胞蛋白每mg重组人胶原7，优选不超过1000ng/mg，更优选不超过600ng/mg。在某些实施方案中，步骤h)的纯化重组人胶原7含有不超过42pg的宿主细胞DNA每mg重组人胶原7，优选不超过25pg/mg，更优选不超过15pg/mg。在某些实施方案中，步骤h)的纯化重组人胶原7含有不超过1.0EU/mg内毒素每mg重组人胶原7，优选不超过0.70EU/mg，更优选不超过0.50EU/mg。在某些实施方案中，该方法在步骤a)之前还包括步骤：a)使从细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种捕获由细胞培养物生产的重组人胶原7的方法，该方法包括：a)使从细胞培养物中收获的上清液接触深度过滤器，其中所述上清液含有重组人胶原7；b)收集流过所述深度过滤器的溶液；c)将来自步骤b)的所述溶液进行超滤步骤，其中所述重组人胶原7浓缩于与超滤膜相邻的层中；d)丢弃第一截留物，其中所述第一截留物包含来自步骤(b)的溶液中含有的杂质；e)使所述与超滤膜相邻的层接触增溶剂和/或表面活性剂以回收重组人胶原7，并获得含有重组人胶原7的第二截留物；f)使所述第二截留物进行渗滤步骤以获得包含重组人胶原7的未纯化的大量液体；以及g)任选地，冷冻所述未纯化的大量液体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.16 US 62/309,0301.一种捕获由细胞培养物生产的重组人胶原7的方法，该方法包括：a)使从细胞培养物中收获的上清液接触深度过滤器，其中所述上清液含有重组人胶原7；b)收集流过所述深度过滤器的溶液；c)将来自步骤b)的所述溶液进行超滤步骤，其中所述重组人胶原7浓缩于与超滤膜相邻的层中；d)丢弃第一截留物，其中所述第一截留物包含来自步骤(b)的溶液中含有的杂质；e)使所述与超滤膜相邻的层接触增溶剂和/或表面活性剂以回收重组人胶原7，并获得含有重组人胶原7的第二截留物；f)使所述第二截留物进行渗滤步骤以获得包含重组人胶原7的未纯化的大量液体；以及g)任选地，冷冻所述未纯化的大量液体。2.根据权利要求1所述的方法，在步骤a)之前还包括步骤：a)培养生产重组人胶原7的宿主细胞；以及b)从所述培养的宿主细胞收获上清液。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述未纯化的大量液体包含从步骤b)收集的溶液中的40-80％的重组胶原7。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中细胞培养包括在生物反应器中培养宿主细胞，所述生物反应器的体积为至少200升，优选至少1500升。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的生物反应器是灌注生物反应器或补料分批生物反应器。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述未纯化的大量液体含有超过50克的重组人胶原7。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述增溶剂包括尿素、硫脲、精氨酸、丁醇、乙醇、高氯酸锂、乙酸锂、乙酸镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、天冬氨酸、谷氨酸、抗坏血酸、谷氨酰胺、天冬酰胺和胍中的至少一种。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述增溶剂包含精氨酸。9.一种用于纯化重组人胶原7的方法，该方法包括：a)使含有重组人胶原7的样品接触混合模式流过树脂，其中所述混合模式流过树脂包括配体活化核和非活性壳，其中所述非活性壳防止重组人胶原7进入配体活化核，并且其中足够小的杂质通过所述非活性壳并与所述配体活化核结合；b)收集流过混合模式流过树脂且含有重组人胶原7的第一流出物；c)在允许所述重组人胶原7与阳离子交换色谱树脂结合的条件下，使来自步骤b)的所述第一流出物接触阳离子交换色谱树脂；d)从阳离子交换色谱树脂洗脱重组人胶原7；e)使从步骤d)洗脱的重组人胶原7以流过模式接触疏水相互作用色谱树脂，并收集流过所述疏水相互作用色谱树脂的第二流出物；f)使步骤f)的所述第二流出物进行超滤步骤以浓缩所述重组人胶原7；g)用缓冲液对来自步骤f)的浓缩的重组人胶原7进行渗滤；以及h)回收纯化的重组人胶原7，其中所述方法包括一个或多个病毒减少步骤和内切核酸酶处理步骤。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述超滤步骤包括切向流过滤器，并且其中所述切向流过滤器包括亲水膜。11.根据权利要求9...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·基尼奥内斯加西亚，B·西蒙尼，R·利利，杨婷，D·尼克尔斯，
申请(专利权)人：菲尼克斯组织修复公司，
类型：发明
国别省市：美国,US