检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术公开了检测沙丁胺醇的荧光微球‑胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法，在底板上依次地搭接粘贴滤纸、样本垫、喷涂有荧光微球‑沙丁胺醇单克隆抗体复合物和胶体金‑沙丁胺醇单克隆抗体复合物的玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述的硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇偶联抗原作为检测线和包被有抗鼠抗体作为质控线。检测线显色比质控线显色浅，则样本中沙丁胺醇含量大于0.5ng/mL，定性判断为阳性。定性判断为阳性的试纸条，直接插入荧光读取仪中，读取仪将荧光微球显色体系的荧光信号数值化，实现定量检测。本发明专利技术主要用于食品安全检测中沙丁胺醇的定性与定量检测。

【技术实现步骤摘要】
检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法
本专利技术属于食品安全中兽药残留检测领域，具体涉及一种可以同时定性并定量检测样品中沙丁胺醇的时间分辨荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)是一种选择性β-2受体激动剂，与盐酸克伦特罗一样具有促进营养再分配和生长的作用，因此被用作新型添加剂促进机体生长。由于沙丁胺醇具有在动物体内蓄积残留的特性，食用沙丁胺醇添加剂饲养的动物会引起人们不同程度的中毒反应，具体表现为骨骼肌收缩增加，引起肌肉震颤。在畜牧业生产中一些非法使用者将其作为一种生长促进剂添加到动物饲料中，增加瘦肉的生长比率。根据农业部第235号公告，沙丁胺醇为禁用添加剂，因此在食品(肉中)不得检出。现行检测标准有GB/T22286-2008《动物源性食品中多种β-受体激动剂残留量的测定》，该方法(高效液相色谱串联质谱法)对沙丁胺醇的检出限为0.5μg/kg。沙丁胺醇国内外主要采用GC-MS，LC-MS，酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金标记免疫层析试纸条等技术来实现定性和定量检测。前三种方法均需借助昂贵而复杂的仪器和设备来完成检测，成本高，并且需要高水平的专业人员来进行操作，实验结果耗时较长，无法实现现场检测，因此不适合于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的快速在线检测和监控。免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它通常以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，通过抗原抗体结合的免疫反应原理，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测线)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验结果(如检测线出现不同颜色的条带)；而游离标记物则越过检测线，达到与结合标记物自动分离之目的。免疫层析技术常见的目测标记载体有胶体金、乳胶、胶体硒等，其中运用最成功的标记物为胶体金。但是，胶体金免疫层析试纸条存在以下缺陷：⑴一般试纸条均为通过肉眼观察结果进行定性分析，无法实现精准的定量检测。⑵不同的材料基质效应明显，样本背景干扰较大，易产生假阳性结果。⑶检测的阳性结果无法保存，通常超过判断时间后，结果不再准确可靠。市场为了满足对样本进行定量检测的需求，各种基于不同标记物的定量检测试纸条也层出不穷，一般目前的定量检测试纸条，都是单一的标记物标记抗体后，通过小型仪器读取显色信号值，再通过绘制标准曲线进行定量检测。目前基于不同元素标记物的荧光免疫层析方法也已经出现，并获得高灵敏度，但是该定量检测方法也存在以下缺陷：⑴实际检测中，阴性结果所占比率很高，但该方法所有试纸条均需要用仪器读取，否则不能得到结果，在做大批量样本检测时，耗时较长！⑵定量检测中，检测部门仍然需要一个阈值来区分阴性和阳性，所以数据处理量较大；⑶单一的荧光微球试纸条灵敏度较高，但在实际应用中，较高的灵敏度其检测线性范围则较窄，样本定量浓度范围并不适合实际中的检测需求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对上述现有技术缺陷，提供一种灵敏度高、检测时间短、操作简便并能同时实现定性和定量检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条。本专利技术的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法。为了实现上述目的本专利技术采取的一个技术方案是：提供一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条。它包括底板，以及在底板上依次地搭接粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所述的玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了沙丁胺醇单抗的复合物，所述的硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线。所述时间分辨荧光微球是直径为0.01～10μm的采用较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的特殊微球，其表面连接有活性基团；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点。所述的胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，其表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条的方法，它包括如下的步骤：⑴硝酸纤维素膜的制备①制备沙丁胺醇人工抗原为了制备硝酸纤维素膜，首先将沙丁胺醇标准品与蛋白大分子通过共价偶联法制备质控区所需的人工抗原，偶联方法为：碳二亚胺法。偶联蛋白可选：牛血清白蛋白和卵清蛋白。②检测线和质控线的制备分别将沙丁胺醇人工抗原和山羊抗小鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，制成检测线和质控线。用0.01～0.1MpH6.0的PBS(磷酸盐缓冲溶液)分别调节包被物浓度为0.1～5.0mg/mL，喷膜量为0.74μL/cm，检测线喷涂沙丁胺醇人工抗原，质控线喷涂抗鼠抗体，两区相隔5mm；37℃烘干过夜处理后，室温干燥的环境下保存备用。⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备①荧光微球通过共价偶联标记沙丁胺醇单抗：取荧光微球超声1min，再用0.01MpH6.0的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后加入对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)使EDC终浓度为10～500mg/mL，振荡混匀后，室温反应30min，在该荧光微球中加入沙丁胺醇单抗使其终浓度为12μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应1～4h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，室温反应1h，然后在6000×g离心5～15min，沉淀用0.01MpH6.0的磷酸盐缓冲液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为起始体积，于4℃保存待用。②胶体金颗粒通过电荷作用和范德华力标记沙丁胺醇单抗：取胶体金(粒径10-100nm)用0.02M的碳酸钾溶液调节pH为7.5，加入沙丁胺醇单抗使其终浓度为18μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应1～4h，然后加入牛血清白蛋白使其终浓度为1％，室温反应1h，在5000×g离心5～15min，沉淀用0.05MpH7.5的磷酸盐缓冲液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶，复溶后体积为起始体积的十分之一，于4℃保存待用。③荧光微球和胶体金抗体标记复合物按照相互影响趋势而确定的比例混合，然后用BIODOTDispensingSystem喷涂至玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，置于室温干燥的环境下备用。⑶试纸条的组装在底板上依次搭接地粘贴下述材料：①滤纸；②样本垫；③喷涂有荧光微球-沙丁胺醇单克隆抗体复合物和胶体金-沙丁胺醇单克隆抗体复合物的玻璃纤维垫；④沙丁胺醇人工抗原作为检测线和山羊抗小鼠抗体作为质控线的硝酸纤维素膜；⑤吸水纸。即组装成本专利技术的沙丁胺醇荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条。用上述的荧光微球免疫层析试纸条检测样本中沙丁胺醇的方法，包括如下的步骤：①在试纸加样孔中加入110μL样本，反应10min；②目测试纸条检测线和质控线出现的红色条带情况；③如果检测线显色比质控线显色深，则样本中沙丁胺醇的含量小于0.5ng/mL，定性判断为阴性，反之，如果检测线显色比质控线显色浅，或者检测线没有显示红色条带，则样本中沙丁胺醇含量大于0.5ng/mL，定性判断为阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测沙丁胺醇的荧光微球‑胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，以及在底板上依次地搭接粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所述的玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了沙丁胺醇单抗的复合物，所述的硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线；所述时间分辨荧光微球是直径为0.01～10μm的采用较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的特殊微球，其表面连接有活性基团；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点；所述的胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，其表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联。

【技术特征摘要】
1.一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，以及在底板上依次地搭接粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所述的玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了沙丁胺醇单抗的复合物，所述的硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线；所述时间分辨荧光微球是直径为0.01～10μm的采用较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的特殊微球，其表面连接有活性基团；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点；所述的胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，其表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联。2.如权利要求1所述的一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：⑴硝酸纤维素膜的制备①制备沙丁胺醇人工抗原为了制备硝酸纤维素膜，首先将沙丁胺醇标准品与蛋白大分子通过共价偶联法制备质控区所需的人工抗原，偶联方法为：碳二亚胺法；偶联蛋白可选：牛血清白蛋白和卵清蛋白；②检测线和质控线的制备分别将沙丁胺醇人工抗原和山羊抗小鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上，制成检测线和质控线；用0.01～0.1MpH6.0的PBS(磷酸盐缓冲溶液)分别调节包被物浓度为0.1～5.0mg/mL，喷膜量为0.74μL/cm，检测线喷涂沙丁胺醇人工抗原，质控线喷涂抗鼠抗体，两区相隔5mm，37℃烘干过夜处理后，室温干燥的环境下保存备用；⑵荧光微球-胶体金复合物垫的制备①荧光微球通过共价偶联标记沙丁胺醇单抗：取荧光微球超声1min，再用0.01MpH6.0的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后加入对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺(EDC)使EDC终浓度为10～500mg/mL，振荡混匀后，室温反应30min，在该荧光微球中加入5～50μg的沙丁胺醇单抗使其终浓度为12μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应1～4h，然后加入牛血清白蛋白(BSA)使其终浓度为1％，室温反应1h，然后在6000×g离心5～15min，沉淀用0.01MpH6.0的磷酸盐缓冲液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶为起始体积，于4℃保存待用；②胶体金颗粒通过电荷作用和范德华力标记沙丁胺醇单抗：取胶体金(粒径10-100nm)用0.02M的碳酸钾溶液调节pH为7.5，加入5～50μg的沙丁胺醇单抗使其终浓度为18μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应1～4h，然后加入牛血清白蛋白使其终浓度为1％，室温反应1h，在5000×g离心5～15min，沉淀用0.05MpH7.5的磷酸盐缓冲液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)复溶，复溶后体积为起始体积的十分之一，于4℃保存待用；③荧光微球和胶体金抗体标记复合物按照相互影响趋势而确定的比例混合，然后用BIODOTDispensingSystem喷涂至玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，置于室温干燥的环境下备用；⑶试纸条的组装在底板上依次搭接地粘贴下述材料：①滤纸；②样本垫；③喷涂有荧光微球-沙丁胺醇单克隆抗体复合物和胶体金-沙丁胺醇单克隆抗体复合物的玻璃纤维垫；④沙丁胺醇人工抗原作为检测线和山羊抗小鼠抗体作为质控线的硝酸纤维素膜；⑤吸水纸；即组装成本发明的沙丁胺醇荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条。3.如权利要求2所述的一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：制备方法包括如下的步骤：(1)硝酸纤维素膜的制备①制备沙丁胺醇人工抗原(SAL-BSA)偶联方法为碳二亚胺法，偶联蛋白为牛血清白蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈媛，赖卫华，罗凯，刘文娟，伍燕华，
申请(专利权)人：江西中德生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西,36