一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，涉及一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法。先提供一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D。再应用所述试剂盒标记微丝细胞骨架，步骤为：1)取授粉的花柱；2)用花柱固定液试剂A对花柱固定；3)用花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤；4)用微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的混合溶液对花柱染色；5)对花柱滴加抗荧光猝灭剂，在激光共聚焦显微镜下观察花柱中花粉管微丝细胞骨架。本发明专利技术所述试剂盒和方法实现了快速、灵敏、准确、简便地观察苹果花粉管内微丝骨架的结构与排列方式。

【技术实现步骤摘要】
一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法
本专利技术属于植物生物
，涉及一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法，特别涉及一种标记苹果自花、异花授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架形态的试剂盒及方法。
技术介绍
植物的细胞骨架包括微丝和微管，它们组成不同的列阵，参与细胞分裂、生长和分化等众多的生理过程。不同真核生物细胞骨架的排列差异很大，花粉管细胞中的微丝骨架在生殖过程中承担着重要的角色。以往的研究主要集中在体外培养花粉管，并观察其细胞微丝骨架的形态；然而，能够清晰直观地观察田间自花和异花授粉后花柱中花粉管的微丝骨架排列，对了解花粉管通过细胞骨架参与信号转导、胞吞胞吐、极性生长过程及有性生殖有着重要的意义。由于授粉后的花柱中花粉管存在材料收集困难及木本植物细胞壁组成成分较为复杂的问题，因此对于苹果花柱中花粉管微丝骨架的研究更为困难。本专利的研究以苹果授粉后，花柱中花粉管为试材，通过田间授粉、花柱固定、花柱中微丝骨架染色、花粉管内花粉管与花柱间胼胝质免疫荧光染色、激光共聚焦观察苹果自花和异花授粉后微丝骨架的排列方式。本专利为直观观察木本植物花粉管内微丝、微管的骨架结构与排列方式提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种标记苹果授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，另一个目的是提供一种高效地标记苹果授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架的方法。一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D；所述花柱固定液试剂A包括：多聚甲醛、EGTA、PIPES、MgCl2和蔗糖；所述多聚甲醛的质量百分比为10％，EGTA的浓度配比为6mmol/L，PIPES的浓度配比为80mmol/L，MgCl2的浓度配比为6mmol/L，蔗糖的质量百分比为18％；所述花柱固定液试剂A的溶剂为双蒸水；所述花柱洗涤液试剂B包括：Tris-HCl、NaCl和Tween；每1L花柱洗涤液试剂B中包括：100mL的Tris-HCl、7g的NaCl和20mL的Tween，所述Tris-HCl的pH为7；所述花柱洗涤液试剂B的溶剂为双蒸水；所述微丝染料试剂C包括：NP-40、Alex-561-phalloidin、Tris-HCl、NaCl和蔗糖；所述NP-40的体积百分比为1％，所述Alex-561-phalloidin浓度配比为200nmol/L，所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述蔗糖的质量百分比为18％；所述微丝染料试剂C的溶剂为双蒸水；所述胼胝质免疫荧光试剂D包括：NP-40、Cellulose、PectolyaseY-23、Tris-HCl、NaCl、甘氨酸、一抗anti-β-1,3-glucenase和二抗FITC-anti-mouse-lgG；所述NP-40的体积百分比为1％，所述Cellulose的质量百分比为3.0％，所述PectolyaseY-23的质量百分比为0.3％，所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述甘氨酸的浓度配比为120mmol/L，所述一抗anti-β-1,3-glucenase的体积比为1:300，所述二抗FITC-anti-mouse-lgG的体积比为1:300；所述胼胝质免疫荧光试剂D的溶剂为双蒸水。一种应用标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的方法，包括如下步骤：1)从田间取人工自花或异花授粉48小时后的花柱；2)在室温下，将花柱置于密闭容器中，并对密闭容器抽真空，在密闭容器中用所述花柱固定液试剂A对花柱固定2.5h；3)在室温下，用所述花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤6次，每次20min；4)在室温下，用所述微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的混合溶液对花柱染色5h，所述微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的体积比为1:1；5)先对花柱滴加抗荧光猝灭剂，然后在激光共聚焦显微镜下观察花柱中花粉管微丝细胞骨架。在上述技术方案的基础上，步骤1)中，所述花柱为先去雄，然后授粉，最后套袋的花柱。在上述技术方案的基础上，步骤3)的具体过程如下：31)将固定后的花柱，先在12000rpm的条件下离心15min，再弃上清；32)用所述花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤6次，每次20min；33)在室温下，用0.18％的NP-40，对花柱浸泡20min；34)在室温下，用0.18％的NP-40，对花柱浸泡6次，每次15min。在上述技术方案的基础上，在进行步骤4)之前，先进行以下步骤：41)将浸泡后的花柱，先在12000rpm的条件下离心10min，再弃上清；42)用洗涤液对花柱洗6次，每次20min，所述洗涤液为水；43)在室温下，加入200nmol/L的Alex-561-phalloidin，对花柱进行染色4h。在上述技术方案的基础上，在进行步骤4)之后，进行以下步骤：45)将染色后的花柱，先在12000rpm的条件下离心15min，再弃上清；46)对花柱用洗涤液洗涤6次，每次20min，所述洗涤液为水；47)在室温下，用Cellulose和PectolyaseY-23的混合液对花柱酶解30min，所述Cellulose的质量百分比为5％，所述PectolyaseY-23的质量百分比为10％；48)在室温下，将花柱置于密闭容器中，并对密闭容器抽真空，在密闭容器中用0.18％的NP-40对花柱浸泡20min；49)在室温条件下，将花柱置于密闭容器中，并对密闭容器抽真空，在密闭容器中用0.15％的NP-40对花柱浸泡，浸泡重复3次，每次20min；410)在室温条件下，用120mmol/L的甘氨酸对花柱封闭1h；411)在4℃的条件下，加入以一抗anti-β-1,3-glucenase为溶质，以TBST溶液为溶剂的混合溶液，所述一抗anti-β-1,3-glucenase与TBST溶液的体积比为1:300，对花柱孵育过夜；412)在室温条件下，加入以二抗FITC-anti-mouse-lgG为溶质，以TBST溶液为溶剂的混合溶液，所述二抗FITC-anti-mouse-lgG与TBST溶液的体积比为1:300，对花柱孵育4h；413)用Tris-HCl、NaCl和甘氨酸的混合溶液对花柱漂洗4次，每次20min；所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述甘氨酸的浓度配比为120mmol/L。在上述技术方案的基础上，所述0.15％的NP-40为：NP-40溶液和TBST溶液的混合溶液；所述NP-40溶液与TBST溶液的体积比为0.15％；所述0.18％的NP-40为：NP-40溶液和TBST溶液的混合溶液；所述NP-40溶液与TBST溶液的体积比为0.18％；所述NP-40溶液包括：Tris-HCl、NaCl和蔗糖；所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为7.0；所述NaCl的浓度配比为300mmo本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，其特征在于，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D；所述花柱固定液试剂A包括：多聚甲醛、EGTA、PIPES、MgCl2和蔗糖；所述多聚甲醛的质量百分比为10％，EGTA的浓度配比为6mmol/L，PIPES的浓度配比为80mmol/L，MgCl2的浓度配比为6mmol/L，蔗糖的质量百分比为18％；所述花柱固定液试剂A的溶剂为双蒸水；所述花柱洗涤液试剂B包括：Tris‑HCl、NaCl和Tween；每1L花柱洗涤液试剂B中包括：100mL的Tris‑HCl、7g的NaCl和20mL的Tween，所述Tris‑HCl的pH为7；所述花柱洗涤液试剂B的溶剂为双蒸水；所述微丝染料试剂C包括：NP‑40、Alex‑561‑phalloidin、Tris‑HCl、NaCl和蔗糖；所述NP‑40的体积百分比为1％，所述Alex‑561‑phalloidin浓度配比为200nmol/L，所述Tris‑HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris‑HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述蔗糖的质量百分比为18％；所述微丝染料试剂C的溶剂为双蒸水；所述胼胝质免疫荧光试剂D包括：NP‑40、Cellulose、PectolyaseY‑23、Tris‑HCl、NaCl、甘氨酸、一抗anti‑β‑1,3‑glucenase和二抗FITC‑anti‑mouse‑lgG；所述NP‑40的体积百分比为1％，所述Cellulose的质量百分比为3.0％，所述PectolyaseY‑23的质量百分比为0.3％，所述Tris‑HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris‑HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述甘氨酸的浓度配比为120mmol/L，所述一抗anti‑β‑1,3‑glucenase的体积比为1:300，所述二抗FITC‑anti‑mouse‑lgG的体积比为1:300；所述胼胝质免疫荧光试剂D的溶剂为双蒸水。...

【技术特征摘要】
1.一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，其特征在于，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D；所述花柱固定液试剂A包括：多聚甲醛、EGTA、PIPES、MgCl2和蔗糖；所述多聚甲醛的质量百分比为10％，EGTA的浓度配比为6mmol/L，PIPES的浓度配比为80mmol/L，MgCl2的浓度配比为6mmol/L，蔗糖的质量百分比为18％；所述花柱固定液试剂A的溶剂为双蒸水；所述花柱洗涤液试剂B包括：Tris-HCl、NaCl和Tween；每1L花柱洗涤液试剂B中包括：100mL的Tris-HCl、7g的NaCl和20mL的Tween，所述Tris-HCl的pH为7；所述花柱洗涤液试剂B的溶剂为双蒸水；所述微丝染料试剂C包括：NP-40、Alex-561-phalloidin、Tris-HCl、NaCl和蔗糖；所述NP-40的体积百分比为1％，所述Alex-561-phalloidin浓度配比为200nmol/L，所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述蔗糖的质量百分比为18％；所述微丝染料试剂C的溶剂为双蒸水；所述胼胝质免疫荧光试剂D包括：NP-40、Cellulose、PectolyaseY-23、Tris-HCl、NaCl、甘氨酸、一抗anti-β-1,3-glucenase和二抗FITC-anti-mouse-lgG；所述NP-40的体积百分比为1％，所述Cellulose的质量百分比为3.0％，所述PectolyaseY-23的质量百分比为0.3％，所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述甘氨酸的浓度配比为120mmol/L，所述一抗anti-β-1,3-glucenase的体积比为1:300，所述二抗FITC-anti-mouse-lgG的体积比为1:300；所述胼胝质免疫荧光试剂D的溶剂为双蒸水。2.一种应用权利要求1所述标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)从田间取人工自花或异花授粉48小时后的花柱；2)在室温下，将花柱置于密闭容器中，并对密闭容器抽真空，在密闭容器中用所述花柱固定液试剂A对花柱固定2.5h；3)在室温下，用所述花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤6次，每次20min；4)在室温下，用所述微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的混合溶液对花柱染色5h，所述微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的体积比为1:1；5)先对花柱滴加抗荧光猝灭剂，然后在激光共聚焦显微镜下观察花柱中花粉管微丝细胞骨架。3.如权利要求2所述的标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的方法，其特征在于：步骤1)中，所述花柱为先去雄，然后授粉，最后套袋的花柱。4.如权利要求2所述的标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的方法，其特征在于：步骤3)的具体过程如下：31)将固定后的花柱，先在12000rpm的条件下离心15min，再弃上清；32)用所述花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤6次，每次20min；33)在室温下，用0.18％的NP-40，对花柱浸泡20min；34)在室温下，用0.18％的NP-40，对花柱浸泡6次，每次15min。5.如权利要求2所述的标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李天忠，杨清，顾钊宇，李威，李洋，于杰，刘春生，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11