基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法，本发明专利技术是以多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP为公共仿生抗体，用三种同一激发波长下的不同发射波长的量子点分别标记甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫三种有机磷农药半抗原，建立简便、快速的仿生荧光免疫分析方法同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫三种有机磷农药。本发明专利技术成本低廉，实验操作简单，结果测定准确，检测限低，适用于各种食品中多种有机磷农药的同时检测。

Simultaneous Detection of Methyl Parathion, Chlorpyrifos and Trichlorfon by Quantum Dot Labeled Biomimetic Fluorescence Immunoassay

The invention discloses a method for simultaneous detection of methyl parathion, chlorpyrifos and trichlorfon based on quantum dot labeled biomimetic fluorescence immunoassay. The method uses multiple recognition sites Fe3O4@SiO2@MIP as public biomimetic antibodies, and uses three quantum dots with different emission wavelengths under the same excitation wavelength to label methyl parathion and poison to death respectively. Three organophosphorus pesticides hapten, tick and trichlorfon, were used to establish a simple and rapid biomimetic fluorescence immunoassay for the simultaneous detection of methyl parathion, chlorpyrifos and trichlorfon. The method has the advantages of low cost, simple experimental operation, accurate result determination and low detection limit, and is suitable for simultaneous detection of various organophosphorus pesticides in various foods.

【技术实现步骤摘要】
基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法
本专利技术涉及一种仿生荧光免疫分析方法，特别是涉及一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法，属于食品安全检测

技术介绍
有机磷农药具有杀虫效率高、防治病虫害范围广、成本低、选择性高等优点，在农业生产中具有广泛的应用前景，但是不合理的使用农药会导致农药残留，威胁人们的食品安全。随着人们对食品安全的日益重视，越来越多的人开始关注农药残留。目前国内外用于食品中多种有机磷农药同时检测的方法大多都是气相色谱与质谱联用；高效液相色谱与质谱联用，但上述检测方法均需要昂贵的仪器和冗长的分析时间。而酶联免疫法虽然具有高灵敏度和低检出限，但是其存在生物抗体制备周期长，保存不当易失活等问题。分子印迹聚合物作为仿生抗体，不但具有高选择性，而且印迹聚合物制备周期短，不存在失活问题，作为人工抗体应用于免疫分析，建立仿生免疫吸附检测技术，用于检测农产品及食品中的农药残留检测，是国内外研究的热点。但农产品中的农药残留往往是多种，大多数仿生免疫分析方法通常用于单一的农药检测。如果要实现全面检测，则需要使用多种的仿生抗体，这将极大的增加农药残留的检测成本。因此，建立用于同时检测农产品及食品中的多种有机磷农药残留的仿生免疫分析方法，对于保障食品安全具有重要意义。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法，以实现对多种有机磷农药残留的同时、快速、灵敏检测。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术的第一方面，提供以二乙基膦酰基乙酸(DPA)为模板分子合成的多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP作为仿生抗体在同时检测多种有机磷农药残留中的应用；所述Fe3O4@SiO2@MIP由如下方法制备而成：将1mmol二乙基膦酰基乙酸溶解在四氢呋喃中，加入1～3mmol3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应；再加入40.00～80.00mgFe3O4@SiO2和4～8mmol正硅酸乙酯，搅拌反应。当0.2～0.5mL氢氧化铵加入后，将混合液在50～70℃下放置8～12h，用甲醇过滤和洗涤，除去未反应试剂和模板分子，干燥，用120～150mL甲醇-乙酸混合溶剂处理12～24h，再用120～150ml甲醇处理，干燥，即得。上述应用中，优选的，所述多种有机磷农药为甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫。本专利技术的第二方面，提供一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测多种有机磷农药的方法，包括以下步骤：以含有有机磷农药公共基团的二乙基膦酰基乙酸(DPA)为模板分子合成的多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP作为仿生抗体；以同一激发波长下的不同发射波长的量子点作为标记物，对所检测的有机磷农药的半抗原进行标记；将不同发射波长量子点标记的半抗原和所检测的有机磷农药混合标准品混合，加入Fe3O4@SiO2@MIP，反应，离心，测定上清液的荧光值，根据荧光值计算不同发射波长下的抑制率，建立所检测的多种有机磷农药的标准曲线，利用标准曲线对待测物中的多种有机磷农药的含量进行测定。作为一种优选的方案，本专利技术的第三方面，提供一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法，包括以下步骤：(1)以二乙基膦酰基乙酸(DPA)作为模板分子，制备得到Fe3O4@SiO2@MIP；(2)以三种具有不同发射波长的CdSe/ZnS量子点分别对甲基对硫磷半抗原、毒死蜱半抗原和敌百虫半抗原进行标记，得到三种量子点标记半抗原；(3)将步骤(2)制备的三种量子点标记半抗原和系列浓度的甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫混合标准溶液混合，然后加入Fe3O4@SiO2@MIP，反应，离心，测定上清液的荧光值，根据荧光值计算不同发射波长下的抑制率，建立甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫三种农药的标准曲线，利用标准曲线对待测物中甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的含量进行测定。优选的，步骤(2)中，对甲基对硫磷半抗原、毒死蜱半抗原和敌百虫半抗原进行量子点标记的具体方法为：分别将甲基对硫磷、毒死蜱、敌百虫半抗原与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和三种不同发射波长的CdSe/ZnS量子点按照200:4000:1～5的摩尔比例加入到反应容器中，充分混匀；加入50～100μL硼酸盐缓冲液(pH7.4)，避光室温反应2～10h；反应结束后，离心除团聚，并将反应物超滤浓缩进行分离纯化。优选的，步骤(2)中，所述CdSe/ZnS量子点的发射波长分别为525nm、585nm和625nm。优选的，步骤(3)中，三种不同发射波长量子点标记的半抗原、甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫混合标准溶液、Fe3O4@SiO2@MIP加入量的比为(1～5)mL:(3～15)mL:(5.00～15.00)mg。优选的，步骤(3)中，所述反应的条件为：室温下振荡30～180min。优选的，步骤(3)中，离心的转速为8000r/min，离心时间为15min。优选的，步骤(3)中，还包括：对待测物进行提取的步骤；所述对待测物进行提取包括：将待测物用甲醇-水溶液进行超声提取，过滤；待测物与甲醇-水溶液加入量的比为5g:(5～15)mL，所述甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为3:17。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术以含有有机磷农药公共基团的DPA作为模板分子合成分子印迹聚合物，使该聚合物对大多数有机磷农药均具有选择吸附性能，可实现多种有机磷农药的同时检测。(2)本专利技术提供的标记物量子点，由于其结构较小，能够促进竞争反应，进而提高检测方法的灵敏度。(3)本专利技术实验操作简单，分析流程短，灵敏度高且检测限低，甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的检测限(IC15)分别为0.21±0.021μgL-1、0.44±0.069μgL-1和0.32±0.033μgL-1。适用于各种食品中多种有机磷农药的快速同时检测。附图说明图1：甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫三种农药的仿生荧光免疫分析方法的标准曲线。具体实施方式应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。本专利技术中所提及的“室温”是指温度为15-30℃。正如
技术介绍
部分所介绍的，现有的仿生免疫分析方法通常用于单一的农药检测，如果要实现全面检测，则需要使用多种的仿生抗体，这将极大的增加农药残留的检测成本。基于此，本专利技术的目的是提供一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测多种有机磷农药的方法。为实现同时检测多种有机磷农药，本专利技术是以含有有机磷农药公共基团的DPA作为模板分子合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，用同一激发波长下的不同发射波长的量子点作为标记物，对所检测的有机磷农药的半抗原进行标记。然后将不同发射波长量子点标记的半抗原和所检测的有机磷农药混合标准品混合，再加入Fe3O4@SiO2@MIP，反应，离心，测定上清液的荧光值，根据荧光值计算不同发射波长下的抑制率，建立所检测的多种有机磷农药的标准曲线，利用标准曲线对待测物中的多种有机磷农药的含量进行测定。由于本专利技术以含有有机磷农药公共基团的DPA作为模板分子合成分子印迹本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以二乙基膦酰基乙酸为模板分子合成的多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP作为仿生抗体在同时检测多种有机磷农药残留中的应用。

【技术特征摘要】
1.以二乙基膦酰基乙酸为模板分子合成的多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP作为仿生抗体在同时检测多种有机磷农药残留中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多种有机磷农药为甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫。3.一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测多种有机磷农药的方法，其特征在于，包括以下步骤：以含有有机磷农药公共基团的二乙基膦酰基乙酸为模板分子合成的多识别位点Fe3O4@SiO2@MIP作为仿生抗体；以同一激发波长下的不同发射波长的量子点作为标记物，对所检测的有机磷农药的半抗原进行标记；将不同发射波长量子点标记的半抗原和所检测的有机磷农药混合标准品混合，加入Fe3O4@SiO2@MIP，反应，离心，测定上清液的荧光值，根据荧光值计算不同发射波长下的抑制率，建立所检测的多种有机磷农药的标准曲线，利用标准曲线对待测物中有机磷农药的含量进行测定。4.一种基于量子点标记仿生荧光免疫分析同时检测甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以二乙基膦酰基乙酸作为模板分子，制备得到Fe3O4@SiO2@MIP；(2)以三种具有不同发射波长的CdSe/ZnS量子点分别对甲基对硫磷半抗原、毒死蜱半抗原和敌百虫半抗原进行标记，得到三种量子点标记半抗原；(3)将步骤(2)制备的三种量子点标记半抗原和系列浓度的甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫混合标准溶液混合，然后加入Fe3O4@SiO2@MIP，反应，离心，测定上清液的荧光值，根据荧光值计算不同发射波长下的抑制率，建立甲基对硫磷、毒死蜱和敌百虫三种农药的标准曲线，利用标...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志祥，高绘菊，姜名荻，徐龙华，孙玉奉，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37