一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法技术

本发明专利技术公开一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术将毕赤酵母内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白，通过检测菌体荧光值来表征重组蛋白的分泌表达量。本发明专利技术使用荧光蛋白(EGFP)荧光值可快速地分析毕赤酵母中重组蛋白的分泌表达量，无需繁琐的操作，简便快速，适用于生物工程及基因工程中检测重组蛋白的分泌表达量，有利于毕赤酵母中高效分泌表达重组蛋白重组菌株的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法
本专利技术涉及基因工程
，涉及一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法，特别涉及一种基于内质网膜蛋白Sec63的毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法。
技术介绍
酵母具有可以有效地进行复杂的翻译后修饰以及将具有生物功能形态的重组蛋白分泌到细胞外等优点，而被广泛地应用于生产工业应用的重组蛋白。其中毕赤酵母(Pichiapastoris)除了具有以上优点，还具有拥有受甲醇严格调控的强启动子PAOX1、合适的糖基化、培养简单易实现高密度发酵、分泌表达的重组蛋白易纯化等优点，目前，已有超过5000种重组蛋白在毕赤酵母中成功表达。虽然大部分重组蛋白的分泌表达量可达到克每升的水平，但也有很多重组蛋白的分泌表达量比较低，需要对重组菌株进行改造以提高重组蛋白的分泌表达量，如增加基因表达盒拷贝、提高蛋白折叠通量等。但经过改造后的菌株仍需要检测重组蛋白的分泌表达量以验证改造是否有效，然后在得到的重组菌株的基础上，进行下一步改造以进一步提高重组蛋白的分泌表达量。对不同重组蛋白，检测其表达量的方法有所不同，如对于重组酶一般是检测其酶活，这些过程一般需要一定的反应时间且比较繁琐。目前，没有较好的方法快速分析重组蛋白的分泌表达量。所以，寻找快速分析重组蛋白分泌表达量的方法显得十分重要。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法，具有简便快速的特点，适用于生物工程及基因工程中检测重组蛋白的分泌表达量。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种含有内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白的毕赤酵母菌株在检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量方面的应用。所述的检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量是通过检测菌体的荧光值实现。本专利技术提供一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法，包括如下步骤：将毕赤酵母内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白，通过检测菌体荧光值来表征重组蛋白的分泌表达量；具体包括如下步骤：(1)构建内质网膜蛋白-荧光蛋白的基因片段，转化进入毕赤酵母的感受态细胞中；(2)制备内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白的毕赤酵母感受态细胞；(3)将表达重组蛋白的载体转化进入步骤(2)中制备的感受态细胞中，涂布于相对应的筛选平板上，获得阳性转化子；(4)将阳性转化子接种于发酵培养基中进行发酵培养，检测其菌体的荧光值，表征重组蛋白的分泌表达量。优选的，所述的内质网膜蛋白为Sec63。优选的，所述的荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP。优选的，所述的毕赤酵母为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。上述毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法在检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量方面的应用。所述的检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量是通过检测菌体的荧光值实现。优选的，本专利技术的实施例以内质网膜蛋白Sec63、增强型绿色荧光蛋白EGFP、毕赤酵母GS115为例：采用在毕赤酵母内源Sec63蛋白融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP，并检测使用该菌株分泌表达重组蛋白时EGFP荧光值与重组蛋白分泌表达量，并分析重组蛋白分泌表达量与EGFP荧光值的关系，具体包括如下步骤：(1)使用重叠延伸PCR制备SEC63-EGFP片段，并将该片段转化毕赤酵母GS115得到Sec63融合表达EGFP的重组菌株GS115-E；(2)制备GS115-E的感受态细胞，将携带六拷贝来源于柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)CGMCC1696的植酸酶基因的载体线性化后转化进入其中，检测诱导期间菌体EGFP荧光值与植酸酶酶活，并分析植酸酶酶活与菌体EGFP荧光值的相关关系。(3)将分别携带一、二、四拷贝的植酸酶基因的载体线性化后转化进入GS115-E的感受态细胞中，检测诱导96h时各重组菌株的菌体EGFP荧光值与植酸酶酶活，并分析植酸酶酶活与菌体EGFP荧光值的相关关系。(4)制备步骤(2)中得到的表达植酸酶的重组菌株感受态细胞，将携带未折叠蛋白响应转化因子基因的载体线性化后转化进入其中，检测两个菌株之间的EGFP荧光值与植酸酶酶活，并分析两个菌株之间EGFP荧光值的增加量与植酸酶酶活的增加量之间的差异。(5)将携带来源于耐盐芽孢杆菌(Bacillushalodurans)C125的木聚糖酶基因的载体线性化后转化进入GS115-E的感受态细胞中，检测诱导期间菌体EGFP荧光值与木聚糖酶酶活，并分析木聚糖酶酶活与菌体EGFP荧光值的相关关系。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术使用EGFP荧光值可以快速地分析毕赤酵母中重组蛋白的分泌表达量，无需繁琐的操作，有利于毕赤酵母中高效分泌表达重组蛋白重组菌株的快速检测。附图说明图1为Sec63融合表达EGFP菌株GS115-E的细胞生长检测；其中，(a)菌株GS115-E诱导96h时的荧光显微镜观察结果，其中实线箭头代表内质网的核膜层，虚线箭头代表内质网的皮质层；(b)菌株GS115与GS115-E的生长曲线。图2为使用菌株GS115-E表达植酸酶时获得的重组菌株GS115-E/P6c的植酸酶酶活与菌体荧光值检测；其中，(a)菌株GS115-E/P6c的植酸酶酶活和菌体EGFP荧光曲线，其中实心图形表示植酸酶酶活，空心图形表示菌体EGFP荧光值；(b)菌株GS115-E/P6c的植酸酶酶活值和菌体EGFP荧光值的相关图。图3为含不同植酸酶基因表达盒拷贝数的菌株诱导96h时植酸酶酶活与菌体荧光值的相关图。图4为使用共表达未折叠蛋白响应转录因子HAC1i进一步增加植酸酶表达量时获得的重组菌株H/P6c的植酸酶酶活与菌体荧光值检测；其中，(a)菌株H/P6c诱导96h时的植酸酶酶活和菌体EGFP荧光值；(b)菌株H/P6c诱导期间的植酸酶酶活值和菌体EGFP荧光值的相关图。图5为使用菌株GS115-E表达木聚糖酶时获得的重组菌株GS115-E/X4c的木聚糖酶酶活与菌体荧光值检测；其中，(a)菌株GS115-E/X4c的木聚糖酶酶活和菌体EGFP荧光曲线；(b)菌株GS115-E/X4c的木聚糖酶酶活值和菌体EGFP荧光值的相关图。图6是本专利技术通过检测EGFP荧光值来表征重组蛋白分泌表达量的示意图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本专利技术通过检测EGFP荧光值来表征重组蛋白分泌表达量的示意图，如图6所示。实施例中涉及如下生物材料：质粒pPICZA-EGFP在文献DOI：10.1007/s10529-012-1055-8”中公开。质粒pPICZA-CREG357C在文献“DOI:10.1038/s41598-017-11494-5”中公开。质粒pPICZA-αE10-HKA/(Phy)6、pPICZA-αE10-phy-HKA、pPICZA-αE10-HKA/(Phy)2、pPICZA-αE10-HKA/(Phy)4、pPICZA-HAC1均在文献“DOI:10.1186/s12896-015-0204-2”中公开。质粒pHKa-4×xyn10在文献“林小琼.基于iTRAQ技术的高效表达木聚糖酶重组毕赤酵母细胞的蛋白组学研究[D].华南理工大学,2013”中公开本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含有内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白的毕赤酵母菌株在检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量方面的应用。

【技术特征摘要】
1.一种含有内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白的毕赤酵母菌株在检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的检测毕赤酵母重组蛋白分泌表达量是通过检测菌体的荧光值实现。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的内质网膜蛋白为Sec63。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的荧光蛋白为增强型绿色荧光蛋白EGFP。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的毕赤酵母为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115。6.一种毕赤酵母重组蛋白分泌表达量的荧光分析方法，其特征在于包括如下步骤：将毕赤酵母内质网膜蛋白融合表达荧光蛋白，通过检测菌体荧光值来表征重组蛋白的分泌表达量；具体包括如下步骤：(1)构建内质网膜蛋白-荧光蛋白的基因片段，转化进入毕赤酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：林影，梁书利，李承，袁清焱，韩双艳，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东,44