一种6-O-去甲罂粟碱的生物催化制备方法技术

本发明专利技术属于生物技术中生物转化领域；一种生物催化法制备6‑O‑去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：取罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱选择性脱甲基化，可得6‑O‑去甲罂粟碱。本发明专利技术所述的生物催化制备6‑O‑去甲罂粟碱的方法仅需一步催化反应即可得到6‑O‑去甲罂粟碱，选择性高，操作简单，条件温和，反应的后处理简单，绿色环保。

【技术实现步骤摘要】
一种6-O-去甲罂粟碱的生物催化制备方法
：本专利技术属于生物技术中生物转化领域，更具体地涉及一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法。
技术介绍
：罂粟碱是一种苄基异喹啉类阿片类生物碱,化学名称为1-[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]-6,7-二甲氧基异喹啉。可从罂粟科植物中提取分离得到。罂粟碱对血管、心脏或其他平滑肌有直接的非特异性松弛作用，具有抗血管痉挛，扩张血管，加速组织扩张等作用。罂粟碱临床应用广泛，可用于治疗大脑、心脏及外周血管痉挛所致的缺血，肾、胆或胃肠道等内脏痉挛。同时还可治疗阴茎勃起障碍以及常规治疗无效的结石性肾绞痛等[1]。研究表明罂粟碱也是潜在的抗肿瘤药物，可抑制肝癌细胞HepG2中端粒酶活性以抑制肝癌细胞的增殖[2]，同时罂粟碱能够通过NF-κB通路诱导前列腺癌细胞PC-3的凋亡[3]。6-O-去甲罂粟碱为罂粟碱的体内代谢产物之一。研究表明，罂粟碱经小鼠及豚鼠肝微粒体代谢可生成6-O-去甲罂粟碱。文献报道，利用丝状真菌Aspergillusalliaceus对罂粟碱生物转化，产物中鉴定得到6-O-去甲罂粟碱[4]。但利用野生型菌株(特别是遗传背景复杂的丝状真菌)全细胞的转化，其转化产物较多，从培养基中分离目标产物繁琐困难。除此研究外，对6-O-去甲罂粟碱的制备未见其他报道。随着当前医学研究的发展，罂粟碱的临床应用范围不断扩大，对罂粟碱的药物代谢动力学研究也随之增加。6-O-去甲罂粟碱作为罂粟碱的代谢产物之一，在罂粟碱的临床药代动力学研究及生物活性、毒性研究中需求日益广泛。由于选择性在罂粟碱的C6位去甲基实现困难，使得目前6-O-去甲罂粟碱对照品价格昂贵。资料显示，美国SDG品牌6-O-去甲罂粟碱市场价格为每10mg对照品售价为16520元(人民币)。另一方面，6-O-去甲罂粟碱为潜在药物先导化合物，因其与罂粟碱具有相同的母核结构，其差异在于侧链氧甲基基团的变化。相关文献及临床研究表明该类化合物侧链氧甲基基团与羟基基团的转变会显著改变其生理活性[5]。研究表明，罂粟碱在使用过程中可能出现肝功能受损的副作用，表现出血嗜酸性细胞、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、门冬氨酸氨基转移酶及胆红素可增高。与罂粟碱相比6-O-去甲罂粟碱其的急性和慢性肝毒性明显降低[6]。6-O-去甲罂粟碱具有复杂的稠环结构，化学全合成困难，也难以选择性地对罂粟碱C6位去甲基化以制备6-O-去甲罂粟碱。基于酶催化的生物催化技术在有机合成中的应用正日益受到广泛关注，具有位点选择性好，条件温和，绿色环保等优势。本专利技术所涉及到的生物催化剂为含有细胞色素P450酶中的一种CYP105D1的酶促催化体系。CYP105D1未见用于6-O-去甲罂粟碱的制备的报道。罂粟碱经人体中的P450酶(肝药酶)代谢可产生包括6-O-去甲罂粟碱在内的多种代谢产物，但人体中的P450酶难以异源表达及用于6-O-去甲罂粟碱的制备。细胞色素P450酶CYP105D1从灰色链霉菌(StreptomycesgriseusATCC13273)中鉴定得到，CYP105D1与人体中的细胞色素P450酶同源性均低于30％。本专利技术开发了含有细胞色素P450酶CYP105D1的生物催化体系在制备6-O-去甲罂粟碱的新用途。参考文献[1]刘绪文，孙云廷.罂粟碱的临床及药理作用研究进展.中国药物与临床,2006,6(9):697-699[2]SKNoureiniandMWink.AntiproliferativeEffectoftheIsoquinolineAlkaloidPapaverineinHepatocarcinomaHepG-2Cells—InhibitionofTelomeraseandInductionofSenescence.Molecules2014,19,11846-11859[3]Papaverineselectivelyinhibitshumanprostatecancercell(PC-3)growthbyinducingmitochondrialmediatedapoptosis,cellcyclearrestanddownregulationofNF-κB/PI3K/Aktsignallingpathway.JBUON2017；22(1):112[4]JP.Rosazza,MKammer,LYouel.MicrobialModelsofMammalianMetabolismO-DemethylationsofPapaverine.Xenobiotica,1977,7(3):133-143.[5]MoJ,GuoY,YangYS,ShenJS,JinGZ,ZhenX(2007)RecentDevelopmentsinStudiesofl-StepholidineanditsAnalogs:Chemistry,PharmacologyandClinicalImplications.CurrentMedicinalChemistry14(28):2996-3002[6]JCDavila,CGReddy,PJDavis,DAcosta.Toxicityassessmentofparaverinehydrochlorideandpapaverine-derivedmetabolitesinprimaryculturesofrathepatocytes.VitroCellular&DevelopmentalBiology,1990,26(5):515-524.
技术实现思路
：1.本专利技术的目的含有细胞色素P450酶CYP105D1的催化体系在制备6-O-去甲罂粟碱中的新用途。本专利技术所采用的技术方案一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱或其盐，选择性脱甲基化，获得6-O-去甲罂粟碱及盐。所述的生物催化剂为CYP105D1，CYP105D1突变体，含有CYP105D1的野生菌株以及表达CYP105D1的工程菌株。CYP105D1来源的野生菌株为灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)ATCC13273。所述的CYP105D1的氨基酸序列为SeqIDNO.1。所述的CYP105D1的突变体的氨基酸序列为SeqIDNO.2、SeqIDNO.3、SeqIDNO.4、SeqIDNO.5或SeqIDNO.6。所述的CYP105D1及其突变体作为催化剂时，还需要细胞色素P450酶系的电子供体及电子传递蛋白。所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的电子传递蛋白为camA和camB所述底物罂粟碱的CAS号为58-74-2，其结构如下所示；盐酸罂粟碱CAS号为61-25-6。本专利技术所述酶法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其合成路线如下所示，即利用CYP105D1生物催化系统对罂粟碱生物转化，转化产物即为6-O-去甲罂粟碱。生物催化反应选择性高，催化效率较高，产物单一便于分离纯化。采用上述生物催化及制备6-O-去甲罂粟碱的技术方案分述如下：1)S.griseusATCC13273制备6-O-去甲罂粟碱技术方案。S.griseusATCC13273菌种保藏培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生物催化法制备6‑O‑去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱或其盐，选择性脱甲基化，获得6‑O‑去甲罂粟碱及盐。

【技术特征摘要】
1.一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱或其盐，选择性脱甲基化，获得6-O-去甲罂粟碱及盐。2.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的生物催化剂为CYP105D1，CYP105D1突变体，含有CYP105D1的野生菌株以及表达CYP105D1的工程菌株。3.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于，CYP105D1来源的野生菌株为灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）ATCC13273。4.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘吉华，沈辰，赵万里，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32