一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法技术

本发明专利技术公开了一种纯化固定化重组α‑淀粉酶的方法，构建α‑淀粉酶‑AcmA融合蛋白重组表达载体，α‑淀粉酶与AcmA锚定区之间添加柔性蛋白Linker，诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行纯化固定化。该方法能够将重组α‑淀粉酶的纯化与固定化结合，减少纯化固定化过程中的步骤，通过该方法固定化的酶，具有很好的酶活和蛋白回收率，同时在长时间保存中能够维持酶活。这种方法能够简化纯化和固定化操作，降低酶活损失。

【技术实现步骤摘要】
一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法
本专利技术涉及一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法。
技术介绍
酶的固定化对于酶的应用具有重要意义，通过固定化，可以使昂贵的酶得到回收利用，同时能够避免在反应体系中引入新的蛋白杂质。酶的固定化被广泛应用于工业催化、发酵、食品等领域。用于固定化的酶可以利用产酶菌株发酵，从天然产物中分离纯化，也可以通过重组表达来得到。重组表达可以提高酶的产量，通过添加适当标签，可以进行亲和层析等方法进行纯化。这些方法需要多步进行，同时也需要一些化学试剂如硫酸铵、咪唑等。因此这些方法存在着周期长、酶活损失等缺点。乳酸乳球菌是一种安全级别(GRAS)的菌。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以特异的结合到乳酸乳球菌的细胞壁上，利用这个特性，通过酸煮沸手段去除乳酸乳球菌中大部分蛋白和DNA，得到了无生命的革兰氏阳性基质(Gram-positiveenhancermatrixparticles，GEM)。将蛋白与AcmA的重组融合，其可以特异的结合到GEM上。GEM锚定AcmA融合蛋白具有以下特点：具有良好的生物安全性、具有良好的机械性能和具有良好的蛋白特异结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化固定化重组α‑淀粉酶的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建α‑淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)测定GEM固定化α‑淀粉酶在不同温度及pH下的酶活及蛋白含量；6)测定GEM固定化α‑淀粉酶的回收效率；7)测定GEM固定化α‑淀粉酶的储藏稳定性；8)GEM材料的回收。

【技术特征摘要】
1.一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于所描述方法步骤如下：1)构建α-淀粉酶与AcmA的融合表达载体，转入大肠杆菌BL21；2)利用IPTG进行诱导表达；3)制备GEM；4)诱导表达产物破碎后，上清与GEM混匀结合，离心分离；5)测定GEM固定化α-淀粉酶在不同温度及pH下的酶活及蛋白含量；6)测定GEM固定化α-淀粉酶的回收效率；7)测定GEM固定化α-淀粉酶的储藏稳定性；8)GEM材料的回收。2.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤1)以乳酸乳球菌NZ9000基因组为模板，扩增得到AcmA锚定区片段，连接到pET28a上得到锚定质粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢杆菌BH072基因组为模板，并添加柔性Linker，扩增得到α-淀粉酶的基因片段，连接到质粒pET28a-AcmA上，得到重组表达质粒pET28a-α-amylase-AcmA，通过化学转化转入大肠杆菌表达载体BL21。3.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤2)划线分离得到带有质粒的BL21的单克隆，过夜培养得到种子液，以1％-5％的接种量接种，当菌液OD600达到0.5-0.8时加入IPTG进行诱导，诱导浓度为0.1mM-1mM，诱导温度选择为25℃-37℃，诱导时间为12小时-24小时，所有培养基为添加50μg/mL卡那霉素的LB培养基。4.根据权利要求1所述的一种纯化固定化重组α-淀粉酶的方法，其特征在于步骤3)制备GEM是指利用含1％葡萄糖的M17培养基培养乳酸乳球菌NZ9000至OD600在2.0-2.5之间，4000rpm离心收集菌体，利用PBS洗涤去除培养基，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl中，煮沸...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志江，赵芳坤，杜仁鹏，韩烨，宋巧智，曹硕，肖华志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12