本发明专利技术公开了一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶的生产方法，该方法通过大肠杆菌重组菌的5L发酵罐高密度培养和诱导表达，对诱导表达后发酵液进行离心收集菌体，高压匀浆法破碎重组菌获得重组蛋白包涵体，重组蛋白包涵体溶解后挂Ni柱亲和层析纯化，经脱盐及冷冻干燥获得重组人艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶。本发明专利技术方法简化了包涵体繁琐的洗涤步骤，通过摸索合适的超声条件将不溶性的包涵体蛋白变成可溶性蛋白，避免了使用8M尿素或6M盐酸胍等强变性剂对包涵体的变性复性操作，通过Ni柱亲和层析所得蛋白纯度在95％以上，回收效率在70％以上，达到了简单有效快速纯化的效果。
【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的生产方法
本专利技术涉及一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的生产方法。
技术介绍
粘多糖贮积症II型又称Hunter综合症，是x基因连锁隐形遗传病，该病病因是细胞溶酶体内艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的基因突变，体内的葡萄糖胺聚糖无法代谢导致皮肤素和硫酸乙酰肝素大量堆积于全身各种脏器和组织溶酶体内而致病。随着葡萄糖胺聚糖的积累，逐渐积累在体内的粘多糖会导致细胞充血、器官肿大、组织破坏及系统功能障碍等疾病。2006年7月24日FDA批准ShireHumanGeneticTherpapies公司的艾杜糖硫酸酯酶注射液上市，商品名为Elaprase，为治疗罕见遗传病MPSII的首个药物。国外有通过哺乳动物CHO细胞表达生产人艾杜糖-2-硫酸酯酶，文献“Low-scaleexpressionandpurificationofanActiveputativeinduronate2-sulfatesulfatase-LikeenzymefromEscherichiacoliK12”中有表达过类似人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，但其基因序列不是全长序列，并且基因序列经过人工改造修饰，目前国内还没有查到利用大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶全长基因的相关文献。而人N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(GALNS)在E.coli(BL21)能够以有活性的方式表达(Poutou,2006；etal.,2010)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的生产方法。针对上述目的，本专利技术所采用的技术方案由下述步骤组成：1、在无菌环境下挑取大肠杆菌菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，32～37℃恒温摇床培养12～16h。2、将步骤1培养后的一级种子火焰接种于发酵培养基中，接种量为5％～10％，32～37℃恒温培养8～12h，降温至30～32℃，恒温培养1～2h，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至发酵液中其浓度为0.6～1.0mmol/mL，并向发酵液中恒速补充补料培养基，每小时补充量为发酵液体积的5％～9％，进行大肠杆菌诱导表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，诱导6～10h后停止发酵，室温离心分离，收集菌体。3、将步骤2收集的菌体用预冷至4～8℃的PBS缓冲液重悬至菌体密度为100～150g/L，于60～80MPa压力下高压匀浆50～60min，通过高压匀浆机的缓冲液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体粗品。4、将重组蛋白包涵体粗品用洗涤液重悬至其浓度为6～10g/L，在60～80MPa压力下高压匀浆30～40min，通过高压匀浆机的洗涤液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体。5、将步骤4得到的重组蛋白包涵体用溶解液重悬至其浓度为6～10g/L，用超声波破碎仪在400～600W功率，开循环5s、闭循环5s、冰水浴超声1h后，室温离心分离，收集上清液。6、将步骤5收集的上清液用平衡A液稀释到重组蛋白包涵体终浓度为0.8～1.5mg/mL，用0.1MNaCl调电导到2.0～2.5ms，稀HCl调pH9.0～9.3；用超纯水以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF柱至基线平整，然后用平衡A液以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF10个柱体积，再以4～8mL/min流速过载上样，上样完成后先用平衡A液以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF10个柱体积，再用洗脱B液与平衡A液体积比为3:7的混合液以10mL/min流速洗脱杂带10个柱体积，最后用洗脱B液以10mL/min流速洗脱，得到目标蛋白溶液。7、将目标蛋白溶液用截留分子量为10kD的超滤膜组件进行超滤脱盐并浓缩，真空冷冻干燥，得到重组人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶。上述步骤2中，所述发酵培养基的组成为：酵母粉5g/L、蛋白胨5g/L、甘油5mL/L、Na2HPO4·12H2O25g/L、K2HPO44g/L、NH4Cl1g/L、NH4SO42g/L、甘氨酸0.5g/L、MgCl20.25g/L、消泡剂0.5mL/L、营养素1mL/L；所述补料培养基的组成为：酵母粉5g/L、蛋白胨5g/L、甘油5mL/L、甘氨酸0.5g/L、MgCl20.25g/L、营养素1mL/L；其中所述的营养素的组成为：CuSO4·5H2O6g/L、KI0.088g/L、MnSO4·H2O3g/L、Na2MoO4·2H2O0.2g/L、H3BO30.02g/L、CoCl6·H2O0.5g/L、ZnCl220g/L、FeSO4·7H2O65g/L、Biotin0.2g/L、浓H2SO45mL/L。上述步骤4中，所述洗涤液的组成为：15％蔗糖、0.25％脱氧胆酸钠、3％正丁醇、0.8％Triton100、20mMTris-HCl，pH9.3。上述步骤5中，所述溶解液的组成为：0.5％β-巯基乙醇、10mMNa2PO4·12H2O、20mMTris-HCl，pH9.3。上述步骤6中，所述的平衡A液是：30mM咪唑、20mMTris-HCl，pH9.3，0.22μm滤膜过滤；洗脱B液是：120mM咪唑、20mMTris-HCl，pH9.3，0.22μm滤膜过滤。本专利技术采用大肠杆菌体系高密度低温诱导表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，通过高压匀浆法破碎大肠杆菌细胞释放人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶包涵体蛋白，溶解液溶解包涵体蛋白，简化了繁琐的包涵体洗涤步骤，溶解后的重组蛋白可以直接上NiSepharoseFF亲和层析柱，避免了使用8M尿素或6M盐酸胍等强变性剂对包涵体进行变性复性操作，所得蛋白纯度可达到95％以上，回收效率70％以上，操作简单，效率高。本专利技术采用大肠杆菌体系表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶全长序列填补了国内重组表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的空白，由于大肠杆菌是一种简单廉价且成熟安全的表达体系，其代谢途径和遗传背景清楚，具有培养周期短，发酵密度高，目标蛋白表达量高，发酵成本低易于工业化放大，下游纯化工艺成熟稳定等优点而成为表达重组蛋白的理想宿主。附图说明图1是实施例1中重组蛋白NiSepharoseFF柱亲和层析纯化前后的SDS-PAGE电泳图，1为重组蛋白高压匀浆破碎后的包涵体粗品上样20μL，2为重组蛋白高压匀浆破碎后的包涵体粗品上样30μL，3和4为洗涤液洗涤后的重组蛋白粗品上样20μL，5和6为NiSepharoseFF柱亲和层析纯化后的重组蛋白纯品上样20μL，M为蛋白Marker26610。图2是NiSepharoseFF柱亲和层析纯化后的重组蛋白纯品的色谱图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术进一步详细说明，但本专利技术的保护范围不仅限于这些实施例。实施例11、无菌环境下挑取大肠杆菌菌落接种于300mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，液体LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L，用稀HCl或者NaOH调节pH7.3，37℃恒温摇床250rpm培养12h，得到一级种子。2、将5L发酵罐湿热灭菌冷却到37℃后本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶的生产方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：(1)在无菌环境下挑取大肠杆菌菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，32～37℃恒温摇床培养12～16h；(2)将步骤(1)培养后的一级种子火焰接种于发酵培养基中，接种量为5％～10％，32～37℃恒温培养8～12h，降温至30～32℃，恒温培养1～2h，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至发酵液中其浓度为0.6～1.0mmol/mL，并向发酵液中恒速补充补料培养基，每小时补充量为发酵液体积的5％～9％，进行大肠杆菌诱导表达人艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶，诱导6～10h后停止发酵，室温离心分离，收集菌体；(3)将步骤(2)收集的菌体用预冷至4～8℃的PBS缓冲液重悬至菌体密度为100～150g/L，于60～80MPa压力下高压匀浆50～60min，通过高压匀浆机的缓冲液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体粗品；(4)将重组蛋白包涵体粗品用洗涤液重悬至其浓度为6～10g/L，在60～80MPa压力下高压匀浆30～40min，通过高压匀浆机的洗涤液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体；(5)将步骤(4)得到的重组蛋白包涵体用溶解液重悬至其浓度为6～10g/L，用超声波破碎仪在400～600W功率，开循环5s、闭循环5s、冰水浴超声1h后，室温离心分离，收集上清液；(6)将步骤(5)收集的上清液用平衡A液稀释到重组蛋白包涵体终浓度为0.8～1.5mg/mL，用0.1M NaCl调电导到2.0～2.5ms，稀HCl调pH 9.0～9.3；用超纯水以10mL/min流速冲洗Ni Sepharose FF柱至基线平整，然后用平衡A液以10mL/min流速冲洗Ni Sepharose FF 10个柱体积，再以4～8mL/min流速过载上样，上样完成后先用平衡A液以10mL/min流速冲洗Ni Sepharose FF 10个柱体积，再用洗脱B液与平衡A液体积比为3:7的混合液以10mL/min流速洗脱杂带10个柱体积，最后用洗脱B液以10mL/min流速洗脱，得到目标蛋白溶液；上述的平衡A液是：30mM咪唑、20mM Tris‑HCl，pH 9.3，0.22μm滤膜过滤；洗脱B液：120mM咪唑、20mM Tris‑HCl，pH 9.3，0.22μm滤膜过滤；(7)将目标蛋白溶液用截留分子量为10kD的超滤膜组件进行超滤脱盐并浓缩，真空冷冻干燥，得到重组人艾杜糖醛酸‑2‑硫酸酯酶。...
【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的生产方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：(1)在无菌环境下挑取大肠杆菌菌落接种于含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，32～37℃恒温摇床培养12～16h；(2)将步骤(1)培养后的一级种子火焰接种于发酵培养基中，接种量为5％～10％，32～37℃恒温培养8～12h，降温至30～32℃，恒温培养1～2h，然后加入异丙基硫代半乳糖苷至发酵液中其浓度为0.6～1.0mmol/mL，并向发酵液中恒速补充补料培养基，每小时补充量为发酵液体积的5％～9％，进行大肠杆菌诱导表达人艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，诱导6～10h后停止发酵，室温离心分离，收集菌体；(3)将步骤(2)收集的菌体用预冷至4～8℃的PBS缓冲液重悬至菌体密度为100～150g/L，于60～80MPa压力下高压匀浆50～60min，通过高压匀浆机的缓冲液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体粗品；(4)将重组蛋白包涵体粗品用洗涤液重悬至其浓度为6～10g/L，在60～80MPa压力下高压匀浆30～40min，通过高压匀浆机的洗涤液用冰水浴冷却确保出口流出液温度不超过37℃，匀浆后室温离心分离，收集沉淀，得到重组蛋白包涵体；(5)将步骤(4)得到的重组蛋白包涵体用溶解液重悬至其浓度为6～10g/L，用超声波破碎仪在400～600W功率，开循环5s、闭循环5s、冰水浴超声1h后，室温离心分离，收集上清液；(6)将步骤(5)收集的上清液用平衡A液稀释到重组蛋白包涵体终浓度为0.8～1.5mg/mL，用0.1MNaCl调电导到2.0～2.5ms，稀HCl调pH9.0～9.3；用超纯水以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF柱至基线平整，然后用平衡A液以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF10个柱体积，再以4～8mL/min流速过载上样，上样完成后先用平衡A液以10mL/min流速冲洗NiSepharoseFF10个柱体积，再用洗脱B液与平衡A液体积比为3:7的混合液以10mL/min流速洗脱杂带10个...
【专利技术属性】
技术研发人员：王俊，郝东，邓晗，史瑾，高恩，赵金礼，杨小玲，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61
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