本发明专利技术公开了酸性磷酸酶及其编码基因与应用。本发明专利技术的酸性磷酸酶为c)或d)的蛋白质：c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；所述a)为由SEQ ID No.2第1‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述b)为由SEQ ID No.2第26‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。本发明专利技术可用于培育高效活化土壤磷素养分的生物工程菌。
【技术实现步骤摘要】
酸性磷酸酶及其编码基因与应用本申请是申请号为201610051653.1、申请日为2016年01月26日、专利技术创造名称为“来源于巨大芽孢杆菌的酸性磷酸酶及其编码基因与应用”的分案申请。
本专利技术涉及生物领域中酸性磷酸酶及其编码基因与应用。
技术介绍
磷是植物生长发育三大必需元素之一，在生命过程中起重要作用。植物利用的磷素主要来源于土壤。目前，我国有2/3的耕地缺磷，缺磷的主要原因是由于土壤中有效磷含量不足，大约95％的磷为难溶性的无效磷，植物很难吸收利用。我国每年大约消耗1050-1200万吨磷肥(2010年中国化工信息网)，但是磷肥当季植物利用率仅为5％-25％，90％左右的磷肥施入土壤后很快被化学固定。因此，提高磷肥利用效率，活化土壤无效磷素是农业生产迫切解决的科学问题之一。溶磷微生物中酸性磷酸酶、肌醇六磷酸酶在土壤有机磷的分解与释放起着关键作用(Yamamuraetal.,2004；赵小蓉等，2001；陈哲等，2009)。酸性磷酸酶(Acidphosphatase，简称ACPase，E.C.3.1.3.2)，是在酸性条件下催化磷酸单酯水解的酶。此酶除了参与磷酸酯的代谢，还参与代谢调节、能量转换以及信号转导等重要生命活动。酸性磷酸酶具有非常重要的功能，其一，酸性磷酸酶具有磷酸水解酶的活性，通过分解有机质的磷一酯键和磷一酐键释放磷，从而活化土壤中无效磷，在充分利用土壤磷资源、减少磷肥施用上具有重要应用价值；其二，酸性磷酸酶也具有磷酸转移酶活性,在合适的条件下,能将低能磷酸基团转移到核苷的羟基上,在核苷酸生化合成上具有较大的应用价值。核苷酸通常作为食品添加剂和医药中间体，其中，肌苷酸(次黄嘌呤-5′-核苷酸)因为具有更明显的助鲜效果，广泛应用于食品加工领域。目前主要有两种方法生产核苷酸，一种是化学合成法，利用菌体发酵产生肌苷，再用POCl3磷酸化，该方法副产物较多，提纯困难；另一种方法是利用大肠杆菌肌苷激酶磷酸化肌苷，此过程需要ATP的参与，而ATP需要通过产氨杆菌发酵再生，限制了酶法合成的应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种磷酸水解酶的活性和磷酸转移酶活性均较高的酸性磷酸酶。本专利技术所提供的酸性磷酸酶，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)由SEQIDNo.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)由SEQIDNo.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端(C末端)或/和氨基端(N末端)融合蛋白标签得到的融合蛋白；d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。上述酸性磷酸酶中，a)所示的蛋白质为来源于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)的完整酸性磷酸酶，其名称为BmacpA；SEQIDNo.2由203个氨基酸残基组成，第1-25位为信号肽。上述酸性磷酸酶中，b)所示的蛋白质为去掉BmacpA的信号肽得到的去信号肽酸性磷酸酶，其名称为NSBmacpA。上述酸性磷酸酶中，蛋白标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化等。c)所示的蛋白质具体可为在NSBmacpA的羧基端或/和氨基端融合组氨酸标签得到的融合蛋白质，如SEQIDNo.6所示的蛋白质，其名称为NSBmacpA-His。SEQIDNo.6由192个氨基酸残基组成。编码上述酸性磷酸酶的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述核酸分子具体可为如下1)或2)或3)或4)所示的基因：1)编码序列(CDS)是SEQIDNo.1所示的DNA分子，其名称为BmacpA基因；2)编码序列是SEQIDNo.1的第76至612位所示的DNA分子，其名称为NSBmacpA基因；3)编码序列是SEQIDNo.5所示的DNA分子；其名称为NSBmacpA-His基因；4)与1)或2)或3)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述酸性磷酸酶的DNA分子。所述核酸分子中，“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。下述A1)、A2)或A3)的应用也属于本专利技术的保护范围：A1)上述酸性磷酸酶在作为磷酸转移酶中的应用。A2)上述核酸分子在制备磷酸转移酶中的应用。A3)上述酸性磷酸酶在制备核苷酸中的应用。上述应用中，所述核苷酸为肌苷酸。本专利技术还提供了制备上述酸性磷酸酶的方法。本专利技术所提供的制备上述酸性磷酸酶的方法，包括使上述酸性磷酸酶的编码基因在生物中进行表达得到上述酸性磷酸酶的步骤；所述生物可为微生物、植物或非人动物。上述方法中，所述使上述酸性磷酸酶的编码基因在生物中进行表达包括将上述酸性磷酸酶的编码基因导入受体微生物，得到表达上述酸性磷酸酶的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到上述酸性磷酸酶。上述方法中，所述受体微生物可为原核微生物。上述方法中，所述原核微生物具体可为革兰氏阴性细菌。上述方法中，所述革兰氏阴性细菌具体可为埃希氏菌属细菌或柠檬酸杆菌属细菌。上述方法中，所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，如大肠杆菌BL21(DE3)。所述柠檬酸杆菌属细菌可为柠檬酸杆菌ACCC02187。上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白质的编码基因可通过重组表达载体pET–NSBmacpA导入所述受体微生物；所述pET–NSBmacpA是用序列表中序列5第4至537位核苷酸所示的DNA分子替换pET-30b(+)的NdeI和HindIII识别位点间的片段得到的重组表达载体。上述方法中，a)或b)或c)或d)的蛋白质的编码基因通过重组表达载体pHT–BmacpA导入所述受体微生物；所述pHT–BmacpA是序列表中序列1所示的DNA分子替换pHT43的BamHI和XbaI识别位点间的片段得到的重组表达载体。实验证明，BmacpA和NSBmacpA均具有磷酸水解酶活性和磷酸转移酶活性，BmacpA和NSBmacpA在37℃、pH5.0的50mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的磷酸水解酶活分别为33.96±1.32U/mg蛋白和37.35±1.55U/mg蛋白；NSBmacpA在37℃、pH值为5、反应30min的肌苷转化率为38％，BmacpA在37℃、pH值为5的条件下反应45分钟的肌苷转化率为36％。本专利技术为应用基因工程手段培育高效利用土壤养分的农作物新品种提供基因资源,可用于培育高效活化土壤磷素养分的生物工程菌。附图说明图1为在大肠杆菌中诱导表达酸性磷酸酶的SDS-PAGE图谱。图1中，M：蛋白Marker；1：空白对照菌粗酶液；2：空载体对照菌粗酶液；3：NSBmacpB-His粗酶液；4：NSBmacpA-His粗酶液。图2为不同pH和反应时间对NSBmacpA-His的磷酸转移酶活性的影响。图3为不同pH和反应时间对NSBmacpB-His的磷酸转移本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.c)或d)的蛋白质：c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；所述a)为由SEQ ID No.2第1‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述b)为由SEQ ID No.2第26‑203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.c)或d)的蛋白质：c)在a)或b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合蛋白标签得到的融合蛋白；所述a)为由SEQIDNo.2第1-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；所述b)为由SEQIDNo.2第26-203位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d)将SEQIDNo.2或SEQIDNo.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有酸性磷酸酶活性的蛋白质。2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于：所述c)的蛋白质为在b)所示的蛋白质的羧基端或/和氨基端融合组氨酸标签得到的融合蛋白质。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于：所述c)的蛋白质为SEQIDNo.6所示的蛋白质，其名称为NSBmacpA-His。4.编码权利要求1-3中任一所述蛋白质的核酸分子。5.A1)、A2)或A3)的应用：A1)权利要求1-3中任一权利要求所述的蛋白质在作为磷酸转移酶中的应用；A2)权利要求4所述的核酸分子在制备磷...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙静文，周卫，程明芳，李书田，王玉军，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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