一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法技术

本发明专利技术提供一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D‑[U‑

【技术实现步骤摘要】
一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法
本专利技术属于分析化学方法领域，具体涉及一种基于稳定性同位素稀释法(isotopedilution,ID)结合二维核磁共振技术用于快速、准确测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的定量方法。更具体地说，涉及一种以D-[U-13C]-葡萄糖作为标记物(示踪物)，改编单量子相关核磁实验(HSQC)以测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的方法(ID-HSQC)。
技术介绍
葡萄糖是人及动物的重要能源物质，在能量代谢中扮演着重要角色。血糖的监测对多种疾病的诊断和治疗具有重要意义，通常血糖浓度的测定是利用酶反应的方法在自动分析仪上测试完成的。然而该方法并不能区分血样中内、外源性葡萄糖，而内、外源性葡萄糖的含量测定是在临床上研究葡萄糖代谢，胰岛素敏感性等实验中的重要参数。目前用于这些临床实验的方法主要方法有：气相色谱-质谱联用方法(GC-MS)、气相色谱-同位素比值质谱联用方法(GC-IRMS)、液相色谱-同位素比值质谱联用方法(LC-IRMS)以及液相色谱-串联质谱联用方法(LC-MS/MS)。但这些方法大多需要除蛋白，衍生化等繁琐的前处理步骤，以及需要相对较大量的同位素示踪物等缺点。因此开发样品前处理简单、同位素标记物用量较少又能准确测定血样中内、外源性葡萄糖的定量方法将具有重要实际应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于稳定性同位素稀释法(isotopedilution,ID)结合二维核磁共振技术用于快速、准确测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的定量方法。更具体地说，涉及一种以D-[U-13C]-葡萄糖作为标记物(示踪物)，改编单量子相关核磁实验(HSQC)以测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度的方法(ID-HSQC)。本专利技术利用较低浓度的D-[U-13C]-葡萄糖(～0.035mM)作为标记物的同位素稀释法(IsotopeDilution)，结合改编的单量子相关核磁实验(HSQC)，简单、准确、快速地同时测定血浆中内、外源性葡萄糖浓度。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D-[U-13C]葡萄糖作为示踪物和内标的同位素稀释法，结合适应性改编的核磁单量子相关实验(ID-HSQC)，测定相应的双峰和单峰的积分比值，以此计算血浆中内、外源性葡萄糖浓度。一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法包括下述步骤：样品制备：取适量的血浆，加入少量氘代试剂，混匀后转移到核磁管；核磁实验：在常规灵敏度增强单量子相关实验的脉冲序列基础上，将碳通道的180度非选择性重聚脉冲改为葡萄糖1号位13C1化学位移选择性重聚脉冲，从而消除δ1，δ2及随后2τ时间内碳碳耦合的演化，即消除了碳碳耦合对谱图相位的影响；在脉冲序列的开始阶段加入90-GZ单元消除碳-13纵向磁化矢量；利用改编的脉冲序列采集二维HSQC实验数据，数据经正弦平方窗函数变迹、零填充、傅立叶变换、相位校正得图谱，积分获取对应信号的积分值；浓度计算：利用核磁实验获得的积分值，通过下面的公式计算出内、外源葡萄糖摩尔浓度比值，如所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法结合了同位素稀释法和HSQC核磁方法并对其进行了适应性改编，样品制备过程简单、标记葡萄糖用量少、能同时准确测定血浆内、外源性葡萄糖浓度。如所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法在样品的制备过程中使用了氘代二甲基亚砜作为锁场试剂，在核磁实验的脉冲序列中利用了选择性重聚脉冲避免相位扭曲。如所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，样品制备只需往待测血浆中加入少量的锁场试剂，混匀后转移到核磁管，操作简单。如所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法使用了氘代二甲基亚砜作为锁场试剂避免活泼氢交换。如所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法对常规的HSQC脉冲序列进行适应性改编，采用了葡萄糖1号位13C化学位移选择性重聚脉冲，消除了同核13C1-13C2一键耦合对图谱相位的影响，从而保证图谱积分和定量分析的准确性。本专利技术的方法可以更具体地描述为：样品制备：取适量的血浆(如480uL)，加入少量氘代试剂(核磁实验锁场用，如20uLDMSO-d6)，混匀后转移到核磁管。核磁实验：为了实现天然丰度和碳-13全标记葡萄糖的同时定量检测，在常规灵敏度增强单量子相关实验的脉冲序列基础上，将碳通道的180度非选择性重聚脉冲改为葡萄糖1号位13C1化学位移选择性重聚脉冲(图1，灰色正弦波型脉冲)，从而消除δ1，δ2及随后2τ时间内碳碳耦合的演化，即消除了碳碳耦合对谱图相位的影响。同时为了消除平衡态碳-13纵向磁化矢量对定量结果的影响，在脉冲序列的开始阶段加入90-GZ单元消除碳-13纵向磁化矢量。利用改编的脉冲序列(图1)采集二维HSQC实验数据，数据经正弦平方窗函数变迹、零填充、傅立叶变换、相位校正等处理步骤后得图谱，积分获取对应信号(图2)的积分值。浓度计算：利用核磁实验获得的积分值，通过下面的公式可以计算出内、外源葡萄糖摩尔浓度比值。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：(1)样品制备简单，只需要取适量血浆后直接加入少量氘代试剂便可以进行检测，而现有的方法的大多需要除蛋白及衍生化等繁琐的前处理步骤。(2)具有较大的同位素稀释比(～1％水平)，同位素标记的示踪物用量少，从而可以降低实验成本。区别于一般的同位素稀释法，为了获得较为准确的定量结果，一般要求检测到的示踪物和被测物的信号强度相当，因而需要的同位素标记的示踪物的用量较大。(3)本专利技术使用改编的单量子相关核磁实验(HSQC)，使用了葡萄糖1号位13C1化学位移选择性重聚脉冲(refocusingpulses)，消除了同核一键耦合(13C1-13C2)对图谱相位的影响，以提高图谱积分及定量分析的准确性。附图说明图1用于内、外源性葡萄糖定量的改编的灵敏度增强HSQC脉冲序列图。图2血浆ID-HSQC图谱(α-D-吡喃型葡萄糖的1号基团信号区域局部放大图)。a)三维图；b)等高线图，中间单峰为α-D-吡喃型葡萄糖的1H-13C1(-12C2)基团信号，两边的双峰为D-吡喃型葡萄糖的1H-13C1(-13C2)基团信号。图3标准曲线。横坐标为标样的理论摩尔浓度比值，纵坐标为通过实验测得的摩尔浓度比值。图4同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法(ID-HSQC)技术路线图。具体实施方式下面结合附图，用本专利技术的实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此来限定本专利技术。本专利技术实施例的数据采集和处理按以下方法进行：该专利技术所涉及的所有核磁实验均在配置QCI-P低温探头的布鲁克AVANCEIII800核磁谱仪上进行。脉冲序列如图1，操控软件TopSpin3.2。使用TopSpin3.5进行数据处理。利用本研究组之前开发的LC-MS/MS方法对测量结果进行验证。液质联用数据处理使用DataAnalysis4.1(Bruker)。实施例1：为了证实利用本专利技术方法测定血浆内、外源性葡萄糖浓度的准确性，本专利技术首先制备一系列不同浓度比例的D-葡萄糖和D本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D‑[U‑13C]葡萄糖作为示踪物和内标的同位素稀释法，结合适应性改编的核磁单量子相关实验ID‑HSQC，测定相应的双峰和单峰的积分比值，以此计算血浆中内、外源性葡萄糖浓度。

【技术特征摘要】
1.一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，利用少量D-[U-13C]葡萄糖作为示踪物和内标的同位素稀释法，结合适应性改编的核磁单量子相关实验ID-HSQC，测定相应的双峰和单峰的积分比值，以此计算血浆中内、外源性葡萄糖浓度。2.一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维核磁共振方法，该方法包括下述步骤：样品制备：取适量的血浆，加入少量氘代试剂，混匀后转移到核磁管；核磁实验：在常规灵敏度增强单量子相关实验的脉冲序列基础上，将碳通道的180度非选择性重聚脉冲改为葡萄糖1号位13C1化学位移选择性重聚脉冲，从而消除δ1，δ2及随后2τ时间内碳碳耦合的演化，即消除了碳碳耦合对谱图相位的影响；在脉冲序列的开始阶段加入90-GZ单元消除碳-13纵向磁化矢量；利用改编的脉冲序列采集二维HSQC实验数据，数据经正弦平方窗函数变迹、零填充、傅立叶变换、相位校正得图谱，积分获取对应信号的积分值；浓度计算：利用核磁实验获得的积分值，通过下面的公式计算出内、外源葡萄糖摩尔浓度比值，3.如权利要求1或2所述的一种同时定量血浆内、外源性葡萄糖的二维...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡凯锋，黄滔，余玲玲，马晓方，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53