一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发相关标记代谢物的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物的方法，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，用解剖刀分离未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶、NMR检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选。本发明专利技术通过对粗枝云杉体胚不同组织样品的代谢组研究，建立了一套高效、快速和重复性好的粗枝云杉体胚代谢组样品前处理、提取、数据处理和差异代谢物筛选的方法，能有效地揭示和评价干化处理影响粗枝云杉体胚从形态学成熟转向生理学成熟的相关代谢信息。

【技术实现步骤摘要】
一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发相关标记代谢物的方法
本专利技术涉及组织培养环节的培养技术、仪器分析技术和数据分析
，具体地说，涉及NMR技术评价干化对粗枝云杉体胚萌发影响的方法。
技术介绍
代谢组学是一种通过分析生物发育过程中的大量代谢物，并研究它们在不同生理和遗传条件下的浓度差异，进而辅助基因表达和蛋白定量的新技术。任何环境胁迫、病理及其它因素对植物生命系统的影响均会引起植物体内代谢物的浓度或代谢流发生变化，而且大多数代谢途径不是孤立存在的，因此代谢组学作为反映某一植物生命过程中整体水平的代谢物质动态变化过程，正在广泛应用于植物功能基因组学、分子表型、分子病理学等领域的研究。粗枝云杉(PiceaasperataMast.)是松科云杉属植物，我国特有树种，分布范围广、材质优良且适应性强。它不仅是重要的用材树种，也是川西高原、甘肃南部和陕西西南部等高山地区森林演替的顶极群落和地带性植被的建群种。目前，粗枝云杉的体细胞胚胎发生技术已基本建立，但其中一些关键环节的内在调控机理还未知，尤其是萌发前体胚内部物质的改变和积累对体胚萌发的作用。干化是体胚萌发前的一种处理方式，能促进体胚的萌发。研究表明，干化主要是使体胚由“形态学”成熟转化为“生理学”成熟，待转入萌发培养基后能获得一个较高的萌发率。目前，对干化促进体胚萌发的分子机理尚不清楚。基于粗枝云杉干化处理前后子叶和胚根代谢组结果分析，对揭示干化的作用机理和发现潜在的标记代谢物均具有重要的意义。但是，目前有关云杉体胚干化处理前后代谢组学的研究国内外尚无报道，尤其是基于NMR技术对云杉代谢组检测的样品处理、提取、数据分析和标记代谢物筛选缺乏可靠的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于NMR技术对粗枝云杉体胚代谢组进行测定和分析，并用来评价干化处理对粗枝云杉体胚萌发能力影响的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供了一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物的方法，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，切取未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶、NMR检测，代谢组数据分析和标记代谢物的筛选。根据本专利技术的方法，所述干化处理方法为：将粗枝云杉分化成熟的体细胞胚置于滤纸上，然后在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m2·s的光照强度条件下培养7-14天，得到干化后的体胚。进一步的，所述干化处理方法具体为：将分化成熟的体胚平铺在1-4层滤纸上，再把带有体胚的滤纸放入小培养皿(35mm)中，每个小培养皿分散放置30-40个胚，然后将不带盖的小培养皿放入大培养皿(90mm)中，最后在大培养皿中加入10mL无菌水(不超过小培养皿三分之二的高度)，加盖密封。在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m2·s的光照强度条件下，处理7-14天。其中，所述的“滤纸法”干化处理中，放置粗枝云杉体细胞胚的培养容器内垫有滤纸的层数优选为2-3层，更优选为2层；光照强度优选为15μmol/m2·s；干化处理时间优选为14天。根据本专利技术的方法，所述分离步骤包括在体视显微镜下切下干化处理后体胚的子叶和胚根，同时切取未干化体胚的子叶和胚根；将切取的目标组织置于冷冻管中，冷冻保存。进一步的，本专利技术的方法中子叶切割的位置位于展开子叶往下0.1～0.3mm处，胚根切割的位置位于胚根尖端往上1～1.5mm处，共4组材料，每组材料6个重复。取样后准确称量单份样品并及时用液氮速冻，温度稳定后放入-80℃冰箱中保存备用。根据本专利技术的方法，所述体胚组织代谢物的萃取方法为：向低温研磨后的样品中加入50％(v/v)的甲醇溶液作为提取剂，在93μm条件下进行超声波萃取，4秒超声，3秒间歇，共循环16次；离心后取上清液于离心管中并用氮气吹干；所述冻干及复溶方法包括：向冻干的样品中加入纯水，涡旋后加入ACDSS试剂，再次涡旋混匀后，离心取上清液，作为NMR检测的提取液。进一步的，体胚组织代谢物的萃取方法为：低温研磨后直接向样品管中加入1000μL提取剂(50％的甲醇溶液，v/v)，涡旋1分钟；冰水浴，在93μm振幅条件下进行超声波萃取，4秒超声，3秒间歇，共循环16次；然后在4℃、13000rpm条件下离心15分钟；取澄清透明上清液600μL于离心管中用氮气吹干提取物。所述冻干及复溶方法为：将提取物放入-80℃冰箱中冰冻1小时，再将提取物放入到冻干机中冻干1小时；加入450μL纯水，涡旋1分钟；取50μLACDSS试剂(内标，4.088mM)于上述离心管中，并涡旋10秒钟(使滤液与ACDSS试剂充分混匀)；在4℃、13000rpm条件下离心2分钟；取480μL上清液于核磁管中，作为NMR检测的样品。NMR检测使用的NMR谱仪为AgilentDD2600MHz三重共振光谱仪。具体检测参数条件如下表所示：本专利技术还提供了粗枝云杉体胚材料代谢组的数据处理方法，具体如下：(1)数据预处理：将1HNMR自由感应衰减(freeinductiondecay,FID)信号导入到ChenomxNMRsuit(version8.0,Chenomx,Edmonton,Canada)软件中，自动进行傅立叶转换，调整相位，校正基线。以DSS-d6峰(0.0ppm)作为全部谱图化学位移的标准，并对其进行反转卷积操作，调整谱图峰形(CSI)。根据1HNMR谱图中信号的相关信息(如化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等)，以DSS-d6峰的浓度和谱峰面积为标准，结合Chenomx自带数据库对24张样本谱图的信号逐一比对分析。然后把代谢物和对应的绝对值浓度导出到EXCEL表格中，即得到了一个代谢物变量矩阵。(2)化学计量学分析：把变量矩阵用样品的最初质量进行归一化后作为源数据进行后续的主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)。从复杂的数据中筛选出样品间的差异代谢标记物。通过对干化前后子叶和胚根的代谢物差异分析，筛选到精氨酸、葡萄糖和奎宁酸可作为判断粗枝云杉体胚萌发能力强弱的标记代谢物。本专利技术还提供了与粗枝云杉体胚萌发能力相关的标记代谢物，所述标记代谢物包括精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸。本专利技术还提供了NMR技术在筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物中的应用，进一步的，所述代谢物为精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸。本专利技术还提供了精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸在作为粗枝云杉体胚萌发标记代谢物中的应用，进一步的，上述代谢物在粗枝云杉体胚萌发过程中的含量上升。本专利技术还提供了精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸作为标记代谢物在指示粗枝云杉体胚萌发强弱的应用，当上述精氨酸、葡萄糖和/或奎宁酸含量上升时，则粗枝云杉体胚萌发能力较强。本专利技术首次将粗枝云杉干化前后体胚的子叶和胚根分开进行检测和分析。本专利技术通过对粗枝云杉体胚材料的代谢组研究，建立一套高效、快速和重复性好的粗枝云杉体胚材料代谢组样品前处理、提取、数据处理和差异代谢物筛选的方法，能有效揭示干化处理影响粗枝云杉体胚萌发密切相关的代谢信息。本专利技术虽以粗枝云杉为例，但对整个针叶树种的体胚材料代谢组的检测、标记代谢物筛选和评价干化处理对其体胚乃至种胚萌发能力影响，均提供了良好的应用前景。附图说明图1.本专利技术采用的基于NMR技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物方法，其特征在于，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，分离未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶，NMR检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选。

【技术特征摘要】
2018.03.02 CN 20181017350561.一种基于NMR技术筛选粗枝云杉体胚萌发标记代谢物方法，其特征在于，包括以下步骤：用“滤纸法”对粗枝云杉体胚进行干化处理，分离未干化体胚的子叶和胚根以及干化后体胚的子叶和胚根，不同体胚组织代谢物的萃取、冻干及复溶，NMR检测，代谢组数据处理和标记代谢物的筛选。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干化处理方法为：将粗枝云杉分化成熟的体细胞胚置于滤纸上，然后在24±1℃、16h光周期和15-18μmol/m2·s的光照强度条件下培养7-14天，得到干化后的体胚。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离步骤包括在体视显微镜下切下干化处理后体胚的子叶和胚根，同时切取未干化体胚的子叶和胚根；将切取的目标组织置于冷冻管中，冷冻保存。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体胚组织代谢物的萃取方法为：向低温研磨后的样品中加入50％(v/v)的甲醇溶液作为提取剂，在93μm振幅条件下进行超声波萃取，4秒超声，3秒间歇，共循环16次；离心后取上清液于离心管中并用氮气吹干；所述冻干及复溶方法包括：向冻干的样品中加入纯水，涡旋后加入ACDSS试剂，再次涡旋混匀后，离心取上清液，作为NMR检测的提取液。5.根据权利要求1所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王军辉，夏燕，景丹龙，欧阳芳群，卢楠，张守攻，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院林业研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11