一种植物病原菌扩大培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种植物病原菌（水稻稻瘟病）扩大培养的方法。主要包括病标样采集—分离纯化—初步放大培养‑浅盘发酵。它是以高粱粒为培养基质，浅盘发酵，在温度为22℃，湿度为90%以上，黑暗培养一周后即可形成大量的分生孢子。本发明专利技术中的培养配方简单，纯度高，产孢量大（可达10

【技术实现步骤摘要】
一种植物病原菌扩大培养的方法
本专利技术属于农业微生物
，涉及一种植物病原菌（水稻稻瘟病）扩大培养的方法。
技术介绍
一、稻瘟病菌的发生与危害稻瘟病，是世界性的重要病害，在我国它同纹枯病、白叶枯病被列为水稻三大病害。由稻梨孢菌(PyriculariaoryzaeCav.)引起，在自然条件下，稻瘟菌只侵染水稻。该病是一种通过气流传播的流行病，其为害程度因品种、栽培技术以及气候条件不同而有差别，一般减产10％－20％，重的达40－50％，局部田块甚至绝收。稻梨孢菌产生的分生孢子无色，洋梨形或棍棒形，常有1-3个隔膜，基部有脚胞，萌发时两端细胞立生芽管，芽管顶端产生附着胞，近球形，深褐色，紧贴附于寄主，产生侵入丝侵入寄主组织内。该菌可分做7群，128个生理小种。该病原菌以分生孢子和菌丝体在稻草和稻谷上越冬，翌年产生的分生孢子借风雨传播到稻株上，萌发侵入寄主向邻近细胞扩展发病，形成中心病株，病部形成的分生孢子，借风雨传播进行再侵染。在气象因素中温度和湿度对发病影响最大，适温高湿，有雨、雾、露存在条件下有利于发病。气温在20-30℃，尤其是在24℃-28℃，阴雨天多，相对湿度保持在90%以上，容易引起稻瘟病严重发生。水稻生长发育过程中，四叶期至分蘖盛期和抽穗初期最易发病。主要为害叶片、茎秆、穗部。因为害时期、部位不同分为苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟、谷粒瘟。苗瘟发生于三叶前，由种子带菌所致。病苗基部灰黑，上部变褐，卷缩而死，湿度较大时病部产生大量灰黑色霉层，即病原菌分生孢子梗和分生孢子；叶瘟在整个生育期都能发生。分蘖至拔节期为害较重。由于气候条件和品种抗病性不同，病斑分为四种类型。节瘟常在抽穗后发生，初在稻节上产生褐色小点，后渐绕节扩展，使病部变黑，易折断。发生早的形成枯白穗。仅在一侧发生的造成茎秆弯曲；穗颈瘟初形成褐色小点，扩展后使穗颈部变褐，也造成枯白穗。发病晚的造成秕谷。枝梗或穗轴受害造成小穗不实；谷粒瘟产生褐色椭圆形或不规则斑，可使稻谷变黑。有的颖壳无症状，护颖受害变褐，使种子带菌。二、进行稻瘟病菌的扩繁的目的1、自身因素造成首先水稻稻瘟病菌生长缓慢，这就增加了病原菌分离、培养难度，要尽可能的减少植株表面和空气中的杂菌的数量，因为杂菌生长一般快于稻瘟病菌，稻瘟病菌就会停止生长或生长弱化，给纯化带来困难。其次稻瘟病菌在普通的PDA真菌培养基上很难产生分生孢子，因为稻瘟病对水稻植株的侵染是通过分生孢子进行的，即分生孢子萌发时两端细胞立生芽管，芽管顶端产生附着胞，紧贴附于寄主，产生侵入丝侵入寄主组织内。不能获得分生孢子，其它相关研究就无从谈起，最后稻瘟病菌在普通培养基上最多可保留1个月，时间过长容易污染，若多代转移，会导致稻瘟病菌致病性下降，产孢更加困难，因此不能得到纯化的病原菌，或者不能产生分生孢子的稻瘟病菌，都会直接影响对该病的研究，尤其是寄主、病原菌之间互做关系的研究。2、筛选推广抗病品种的需要抗病性鉴定（evaluationofdiseaseresistance）是抗病育种的重要基础，抗病鉴定工作是培育抗病品种的重要环节，种植和选育抗病品种是防治作物病害经济有效方法，选用抗病品种是丰产和稳产的重要基础，也是保证国家粮食安全和政局稳定的根本措施。利用农作物抗病虫品种防治病虫危害则是实现持续农业的重要保证，它既有利于农作物连年稳产、高产、优质，节省大量人力物力，降低农业投资，又不污染环境，有利于提高人类的健康水平，更不会污染农产品引起人畜农药中毒甚至死亡。目前，抗病虫作物品种的选育、抗性鉴定评价与利用已得到各级政府部门的高度重视。农业部也出台了高感病品种“一票否决制”，以阻止抗性差的品种在生产应用而造成严重损失。因此，通过人为的扩繁病原菌，使其产生大量的分生孢子，在水稻易发病的关键时期，通过控制局部气候条件，将稻瘟病菌分生孢子与水稻植株接触，诱发水稻品种发病，用于筛选抗病性强的品种。3、研究筛选防治稻瘟病的化学药剂的需要明确稻瘟病菌的繁殖生长条件，了解他的致病性，同时检测化学药剂的活性，病原菌的孢子遇到适当的温度和水分，即开始萌发，通过抑制孢子萌发做指标测定药剂抗菌活性优点是，只要获得孢子方法简单，试验就能在短时间内进行，而且供试药剂的需要量极少，试验结果便于在数量上归纳。
技术实现思路
本专利技术提供一种水稻稻瘟病病原菌的扩大培养、能够产生大量分生孢子的方法。以高粱粒为培养基质，浅盘发酵，在温度为22℃，湿度为90%以上，黑暗培养一周后即可形成大量的分生孢子。本专利技术的方法可以使稻瘟病菌产生大量的分生孢子，分生孢子能够长期保存，且孢子活性至少保存2年以上，对科学研究具有重大意义。为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：（1）病原菌的分离：采集水稻稻瘟病典型病样，用75%酒精消毒处理病组织30s，然后用无菌水冲洗干净，将处理后的病组织放于含有阿米卡星注射液（针剂）的PDA固体培养基中培养（用量为1%），所述PDA培养基成分是马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，分装在250ml三角瓶中。（2）斜面纯化培养：将分离出的病原菌在显微操作仪上挑单孢，每个单孢分别在PDA斜面培养基上进行培养，培养温度25℃，培养时间7-10天；所述的PDA斜面培养基成分同（1），分装于试管中；（3）三角瓶扩大培养：将煮好的高粱粒装入三角瓶、500毫升的三角瓶装到瓶高1/3处，121℃,1h高压灭菌，晾凉后，将试管中的单孢菌落转移到装有高粱粒的三角瓶中，混拌均匀，培养7天；（4）浅盘发酵：提前将搪瓷盘用酒精或开水冲刷，将长满菌的三角瓶中的高粱粒掏出来，打断菌丝后，平摊在搪瓷盘上，覆盖纱布保湿，温度为22℃，湿度为90%，10-15天即可获得产生大量分生孢子的培养体。本专利技术所述的植物病原菌扩大培养方法，可得到分生孢子105个/克，分生孢子储存时间2年以上。本专利技术中的培养配方简单，纯度高，产孢量大，储存时间长，可用于水稻品种抗病性测试、化学药剂筛选及稻瘟病菌致病机理等科学研究。本专利技术主要解决了-水稻稻瘟病菌实验室培养条件下产孢难度大，长期储存致病力下降等问题，重点考察了水稻稻瘟病菌分离纯化、扩大培养等技术指标，主要的难点在于水稻稻瘟病菌培养过程容易污染，长期储存致病力下降等问题，为此先后考察了水稻稻瘟病菌分离纯化方法，扩大培养配方、培养条件等内容；最后确定的方案是：分离、纯化、三角瓶初步扩繁、浅盘发酵四个操作步骤。附图说明图1为浅盘发酵获得的稻瘟病菌；图2为浅盘发酵获得的稻瘟病菌分生孢子；图3为分生孢子接种水稻植株发病情况；图4为普通培养基培养的稻瘟病菌；图5为未发病接种后未发病水稻植株。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。本专利技术所用原料及试剂均有市售。实施例1(1)病原菌的分离：采集水稻稻瘟病典型病样，采用常规的组织分离法进行病原菌的分离，即用75%酒精消毒处理病组织30S，然后用无菌水冲洗干净，将处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物病原菌扩大培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）病原菌的分离：采集水稻稻瘟病典型病样，用75%酒精消毒处理病组织30s，然后用无菌水冲洗干净，将处理后的病组织放于含有1%（w/w）阿米卡星注射液的PDA固体培养基中培养；所述PDA培养基成分是马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，分装在250ml三角瓶中；（2）斜面纯化培养：将分离出的病原菌在显微操作仪上挑单孢，每个单孢分别在PDA斜面培养基上进行培养，培养温度25℃，培养时间7‑10天；所述的PDA斜面培养基成分指的是马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，分装于试管中；（3）三角瓶扩大培养：将煮好的高粱粒装入三角瓶、500毫升的三角瓶装到瓶高1/3处，121℃,高压灭菌1h，晾凉后，将试管中的单孢菌落转移到装有高粱粒的三角瓶中，混拌均匀，培养7天；（4）浅盘发酵：将搪瓷盘用酒精或开水冲刷，然后将长满菌的三角瓶中的高粱粒掏出来，打断菌丝后，平摊在搪瓷盘上，覆盖纱布保湿，温度为22℃，湿度为90%，10‑15天即可获得产生大量分生孢子的培养体。

【技术特征摘要】
1.一种植物病原菌扩大培养的方法，其特征在于按如下步骤进行：（1）病原菌的分离：采集水稻稻瘟病典型病样，用75%酒精消毒处理病组织30s，然后用无菌水冲洗干净，将处理后的病组织放于含有1%（w/w）阿米卡星注射液的PDA固体培养基中培养；所述PDA培养基成分是马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000ml，分装在250ml三角瓶中；（2）斜面纯化培养：将分离出的病原菌在显微操作仪上挑单孢，每个单孢分别在PDA斜面培养基上进行培养，培养温度25℃，培养时间7-10天；所述的PDA斜面培养基成分指的是马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨秀荣，孙淑琴，刘春艳，
申请(专利权)人：天津市植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12