一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗技术

本发明专利技术属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。利用本发明专利技术所述方法培养的LMH细胞用于禽腺病毒4型的培养，可在极大地降低生产成本的同时保证病毒的效价，该工艺在较短的时间60h内，即可稳定获得滴度10

【技术实现步骤摘要】
一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗。
技术介绍
禽腺病毒4(FAV-4)型具备高致病性的特点，可直接引发心包积液-肝炎综合征，目前针对高致病性的FAV-4，疫苗是有效的防控措施。常规的培养FAV-4病毒多采用鸡胚成纤维细胞、鸡肝肾细胞、雏鸡肾细胞、鸡胚肝细胞4种原代细胞，但原代肝肾细胞存在制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备过程中易混入鸡胚成纤维细胞，不利于试验操作。1981年，一位日本学者通过使用二乙基亚硝胺对雄性鸡进行诱导产生肝癌，从肝癌组织分离得到一株鸡肝癌细胞系(LMH细胞系)，且有相关报道可以将该细胞系用于病毒培养。如中国专利申请CN105420198A，专利技术人利用鸡肝癌细胞作为鸭瘟病毒的宿主，证明了鸡肝癌细胞用于培养病毒的可行性。除此之外，也有利用LMH细胞培养禽腺病毒4型的报道，但是均存在培养条件复杂，成本较高，且病毒滴度较现有技术无明显技术优势。鸡传染性法氏囊病是呼肠弧病毒引起的一种雏鸡急性、接触性传染病。该病具有发病突然、病程短、死亡率高的特点，且可引起鸡体免疫抑制，是传统养鸡业的主要传染病之一。H9亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。主要表现为轻度的呼吸道症状，采食量减少，产蛋率降低，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30％左右死亡，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失，更重要的，H9亚型禽流感病毒还可以感染人，对人类健康存在严重的威胁。鸡城新疫俗称鸡瘟，是由鸡城新疫病毒引起的一种高度接触性、急性、烈性传染病，具有高发病率和病死率的特点，在世界各地均有发生，一旦爆发将给养殖业带来毁灭性的打击。目前市场上已有利用LMH细胞系生产的针对禽腺病毒4(FAV-4)和鸡传染性法氏囊病的二联疫苗，以及针对鸡城新疫、禽腺病毒4(FAV-4)和H9亚型禽流感病毒的三联疫苗，但较现有技术并无明显的优势，普遍存在生产成本高缺点，疫苗的攻毒保护力仍有待提高的空间。由此，有必要提供一种满足以下特点的LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法：-其LMH细胞和病毒培养条件简单，易于操作；-其病毒培养时间短；-其病毒滴度高；-其生产成本低。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法及疫苗，该生产工艺培养条件简单，成本低，病毒培养时间短，病毒滴度高。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；S2、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.5～2.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；S3、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.5～3.2％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层。优选地，所述步骤S1～S3中胰酶-EDTA为含有0.025％(m/v)的胰酶、0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。优选地，所述步骤S1所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为0.25％(v/v)。优选地，所述步骤S2所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为1.25％(v/v)。优选地，所述步骤S3所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为2.5％(v/v)。优选地，所述病毒接种繁殖步骤具体为：将禽腺病毒4型接种到制备得到的LMH细胞单层中并进行病毒吸附，使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清和100IU/ml青霉素的细胞维持液于37℃、5％CO2培养60h，直至细胞病变CPE达到80％以上，收获细胞毒液。优选地，所述病毒收集、浓缩、纯化步骤具体为：将收获的细胞毒液于-20℃反复冻融2～3次，离心，超滤浓缩，即得制苗病毒液。优选地，所述疫苗成品配制步骤具体为：往制苗毒液中加入灭活剂进行灭活，得疫苗抗原，往疫苗抗原中加入常规乳化剂乳化制得灭活疫苗。本专利技术另一目的是提供一种禽腺病毒4型疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液进行病毒含量测定，测得每0.1ml病毒液含量为108.5TCID50以上，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。本专利技术另一目的是提供一种鸡传染性法氏囊和禽腺病毒4型二联灭活疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液和鸡传染性法氏囊病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡传染性法氏囊病毒含量≥108.0TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。本专利技术另一目的是提供一种鸡新城疫、禽流感H9亚型病毒和禽腺病毒4型三联灭活疫苗，通过将上述制备得到的禽腺病毒4型病毒液与鸡新城疫病毒液和禽流感病毒液等体积混合，使得每0.1ml水相中禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50，鸡新城疫病毒含量＞108.3TCID50，禽流感H9亚型病毒≥107.5TCID50，灭活，浓缩，加入常规的疫苗抗原乳化剂制得。本专利技术其中一个关键点在于，LMH细胞系的培养中采用了一种创新的细胞培养液，其优选含有新生牛血清、100IU/ml青霉素以及N-乙酰-D-氨基葡萄糖。另外一个关键点在于，通过设置DMEM培养基中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量梯度呈低到高的趋势对LMH进行培养，能够实现低成本，短时间培养高滴度禽腺病毒4型病毒的目的。经过试验发现，加入N-乙酰-D-氨基葡萄糖培养LMH细胞系能够显著提高经LMH细胞培养的禽腺病毒4型的病毒滴度；而通过逐步增加DMEM培养基中的N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量来培养LMH细胞，能够明显减缓病毒培养过程中LMH细胞出现病变的时间。本专利技术具有以下优点：利用本专利技术所述方法培养的LMH细胞用于禽腺病毒4型的培养，可在极大地降低生产成本的同时保证病毒的效价，该工艺在较短的时间60h内，即可稳定获得滴度108.5TCID50/0.1ml以上的禽腺病毒4型病毒，与现有技术相比具有明显的技术优势。用高滴度的疫苗抗原制备的疫苗可显著提高疫苗的免疫力，经免疫攻毒试验结果证明，对禽腺病毒4型攻击可100％保护。具体实施方式以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下实施例。实施例1、LMH细胞的制备S1、使用含有0.8％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.25％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，其特征在于，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶‑EDTA对细胞进行消化和分散；S2、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.5～2.0％(v/v)N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶‑EDTA对细胞进行消化和分散；S3、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.5～3.2％(v/v)N‑乙酰‑D‑氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层。

【技术特征摘要】
1.用LMH细胞系生产禽腺病毒4型疫苗的方法，包括LMH细胞系制备，病毒接种繁殖，病毒收集、浓缩、纯化和疫苗成品配制步骤，其特征在于，所述LMH细胞系制备包括以下步骤：S1、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.01～1.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对LMH细胞进行培养，至细胞生长至30～55％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；S2、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及0.5～2.0％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S1得到的LMH细胞进行培养，至细胞生长至60～75％密度，使用胰酶-EDTA对细胞进行消化和分散；S3、使用含有0.1～1.0％(v/v)新生牛血清、100IU/ml青霉素以及1.5～3.2％(v/v)N-乙酰-D-氨基葡萄糖的细胞培养液对步骤S2得到的LMH细胞进行培养，直至形成生长良好的细胞单层。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为0.25％(v/v)。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为1.25％(v/v)。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3所述细胞培养液中新生牛血清含量为0.8％(v/v)，所述N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量为2.5％(v/v)。5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述病毒接种繁殖步骤具体为：将禽腺病毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张毓金，严悌昆，谢秉超，敖艳华，
申请(专利权)人：广东渔跃生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44