鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法技术

一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计了一对引物，上游引物序列如SEQ NO:1所示，下游引物序列如SEQ NO:2所示；引物在DTMUV BYD‑1株的靶序列被人工连接到pUC57载体上，形成标准品重组质粒；分别以标准品重组质粒和待测样品中的核酸为模板，进行qPCR扩增反应；反应后采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值并进行熔解曲线分析，当Ct值≤36且Tm值在82.9~83.3之间时，样品中含有鸭坦布苏病毒，为阳性；建立标准曲线，得待测样品含量。本发明专利技术方法可以检测鸭坦布苏病毒分离株以及WF100活疫苗，灵敏性高，特异性好。

【技术实现步骤摘要】
鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法以及引物，该检测方法能够定量检测鸭坦布苏病毒。
技术介绍
坦布苏病毒（Tembusuvirus，TMUV）是黄病毒属的成员，核酸类型为ssRNA，属于恩塔亚病毒血清群，该病毒会导致鸭的产蛋量大幅下降，并常伴有脑炎和卵巢炎。1955年，在马来西亚吉隆坡的三带喙库蚊体内首次分离到该病毒。此后，从南亚和中国的库蚊和鸭、鹅、鸡、鸽及麻雀等多种禽类中接连分离到该病毒。2000年，在马来西亚的肉鸡中发现该病毒感染，表现为脑炎和生长阻滞。2010年，我国东南沿海蛋鸭大面积爆发TMUV感染，此后在我国大部分产鸭地区，包括北京、江苏、上海、浙江和重庆等地都有鸭产蛋减少症的报道。而且，从2013年起，我国的鸭坦布苏病毒疫情向东南亚的泰国等地蔓延。系统发生分析表明TMUV在禽类中没有物种屏障，包括东南亚和中国两个世系，传播方式暂不明确。在山东和云南捕获的尖音库蚊和三带喙库蚊中，用病毒分离或RT-PCR检测到TMUV的比例很高。在山东进行的血清学筛查表明有人类感染TMUV，但是未有人类感染发病的报道。在东南亚人群中，该病毒抗体阳性率达50%左右。虽目前尚未报道有临床症状，但对人类仍可能存在很高的风险，需提高警惕。目前国内已有多家机构建立了鸭坦布苏病毒的血清学或核酸检测方法，其中核酸检测方法有普通PCR、染料法qPCR、探针法qPCR、LAMP及宏基因组学等方法。虽然探针法qPCR可能具有更高的特异性，但是染料法qPCR可以避免因基因突变而可能造成的探针法漏检，因此被广泛应用。对于鸭坦布苏病毒的核酸检测，通常针对于保守的包膜蛋白（E蛋白）基因，也有部分研究者针对NS2a、NS3和NS5等基因进行引物设计。2013年，刘宗梁等针对DTMUVBYD-1株的E蛋白基因设计一对引物并建立一步法SYBRGreenRT-PCR，不与DPV、DHV、DRV、DPVV、EDSV、NDV及AIV交叉，最低可以检测20copies的体外转录RNA，在鸭的肝和卵巢等疑似病料中DTMUV阳性率为74%。2015年，刘青涛等针对DTMUV的NS2a基因设计一对引物并建立一步法SYBRGreenRT-PCR，不与NDV、AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV及CSFV交叉，最低可检测10copies的体外转录RNA，在人工感染鸭泄殖腔拭子中DTMUV阳性率为100%。2016年，提金凤等针对DTMUVSDLC等6株的E蛋白基因设计一对引物并建立SYBRGreenPCR，不与AIV、NDV、E.coli和肠炎沙门菌交叉，最低可检测10copies/μL重组质粒，在人工感染小鼠肝、脾和脑样本中DTMUV阳性率为100%。虽然目前多个机构已建立了DTMUV的PCR方法，但目前仍未见形成商业试剂盒。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法以及引物，本专利技术的检测方法具有很高的灵敏性和很好的特异性。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种鸭坦布苏病毒的引物对，其中一条引物DTMUV-F为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的上游引物，该上游引物的序列为5’-GGCAATGGCTGTGGCTTGTT-3’（如SEQNO:1所示）；另一条引物DTMUV-R为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的下游引物，该下游引物的序列为5’-TTGTGGTAGGTGCTCGCTTCC-3’（如SEQNO:2所示）。为达到上述目的，本专利技术采用的一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法的技术方案是：包括以下步骤：第一步，引物和标准品重组质粒的合成：针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计了上述的一对引物，所述引物在DTMUVBYD-1株（GenBank登录号JF312912.1）的靶序列被人工连接到pUC57载体上，形成标准品重组质粒；标准品重组质粒干粉用TE缓冲液重悬后用NanoVue测定浓度，稀释至2.0×109copies/μL，-80℃保存备用。第二步，分别以所述标准品重组质粒和待测样品中的核酸为模板，进行qPCR扩增反应，其中，所述标准品重组质粒的梯度浓度为2.0×108~2.0×10-1copies/μL，每个梯度浓度重复3次，qPCR扩增反应的20μL反应体系为：2×SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus）（生产厂商宝生物工程，货号RR420A）10μL；50×ROX0.4μL；引物DTMUV-F20μM，0.2μL；引物DTMUV-R20μM，0.2μL；去离子水4.2μL；核酸模板5μL；qPCR扩增反应后，采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值并进行熔解曲线分析，当Ct值≤36且Tm值在82.9~83.3之间时，代表生物样品中含有鸭坦布苏病毒，为阳性；当Ct值大于36，或者Tm值小于82.9或大于83.3时，代表生物样品中不含有鸭坦布苏病毒，为阴性；第三步，通过所述标准品重组质粒的Ct值和各个梯度浓度建立标准曲线，最后，根据标准曲线和待测样品的Ct值得到待测样品的含量。上述技术方案中的有关内容解释如下：1、上述方案中，在所述第二步中，qPCR扩增反应条件为：在qPCR仪（生产厂商BIO-RAD，货号CFX96）中，95℃预变性30s，之后扩增40个循环，每个循环95℃变性5s，60℃退火延伸31s，采集信号；循环结束后65℃~95℃以0.1℃递增，每个温度处理5s，读值并绘制熔解曲线。本专利技术的设计原理以及有益效果是：本专利技术通过比较公布的鸭坦布苏病毒核酸序列，在鸭坦布苏病毒的E蛋白基因保守区域设计一对引物，用构建的重组质粒建立标准曲线，分析所建立SYBRGreenqPCR的扩增效率、线性范围以及检测下限；之后，用多种鸭坦布苏病毒毒株以及其他常见禽类病毒进行敏感性和特异性分析，并与一些已公布的鸭坦布苏病毒qPCR引物进行比较，结果表明本专利技术以重组质粒为模板的扩增效率为90.5%，在2.0×101~2.0×108copies/μL范围内具有良好的线性关系，最低检测限为100拷贝/反应。本专利技术的qPCR方法可以检测鸭坦布苏病毒分离株以及WF100活疫苗，灵敏性比一些已发表文献中的其他3对引物高10倍，且特异性很好。本专利技术的qPCR方法为鸭坦布苏病毒PCR商业诊断试剂盒研制奠定了基础。附图说明附图1为DTMUVSYBRqPCR分析敏感性图，横坐标是扩增循环数Ct，纵坐标是相对荧光单位RFU；附图2为DTMUVSYBRqPCR产物电泳图谱；其中，泳道1为50bpMarkerLadder；泳道2~4依次为10-7~10-5倍稀释的DTMUVRNA的qPCR产物；泳道5为2×103拷贝/反应重组质粒的qPCR产物。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：实施例：一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法以及用于该方法的引物对一、引物的设计和合成根据现有公开的鸭坦布苏病毒（DTMUV）的基因保守序列，通过Blast验证，设计并合成了一对特异性引物。其中一条引物DTMUV-F为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的上游引物，该上游引物的序列为5’-GGCAATGGCTGTGGCTTGTT-3’（如SEQNO:1所示）；另一条引物DTMUV-R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸭坦布苏病毒的引物对，其特征在于：其中一条引物DTMUV‑F为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的上游引物，该上游引物的序列为5’‑GGCAATGGCTGTGGCTTGTT‑3’；另一条引物DTMUV‑R为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的下游引物，该下游引物的序列为5’‑TTGTGGTAGGTGCTCGCTTCC‑3’ 。

【技术特征摘要】
1.一种鸭坦布苏病毒的引物对，其特征在于：其中一条引物DTMUV-F为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的上游引物，该上游引物的序列为5’-GGCAATGGCTGTGGCTTGTT-3’；另一条引物DTMUV-R为针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计的下游引物，该下游引物的序列为5’-TTGTGGTAGGTGCTCGCTTCC-3’。2.一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：第一步，引物和标准品重组质粒的合成：针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计了权利要求1所述的一对引物，所述引物在DTMUVBYD-1株的靶序列被人工连接到pUC57载体上，形成标准品重组质粒；第二步，分别以所述标准品重组质粒和待测样品中的核酸为模板，进行qPCR扩增反应，其中，所述标准品重组质粒的梯度浓度为2.0×108~2.0×10-1copies/μL，每个浓度梯度重复3次，qPCR扩增反应的20μL反应体系为：2×SYBR®PremixExTa...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，时长军，李永旺，王凯民，张嵘，陈雷，朱婷，陆春华，
申请(专利权)人：中华人民共和国苏州出入境检验检疫局，苏州西山生物技术有限公司，江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32