鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用技术

本发明专利技术涉及一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用，所述引物为：上游引物F：5’‑GCTAGACAGATCGAGGGAGG‑3’；下游引物R：5’‑GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG‑3’。鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法：利用上述引物，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型进行鉴别。本发明专利技术的PCR引物特异性强，能够对鸭腺病毒C型以及鸭腺病毒B型进行有效的扩增，本发明专利技术的鉴定方法简单、经济、方便高效、准确率较高。

【技术实现步骤摘要】
鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用
本专利技术涉及一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物及其鉴别方法以及应用。
技术介绍
根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类，腺病毒科(Adenoviridae)下设5个属(Genus)：禽腺病毒属(Aviadenovirus)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)。腺病毒为双链DNA无囊膜病毒，呈二十面体对称，衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，12个则是五邻体基底(顶点壳粒)，每个五邻体基底结合着1根至2根纤突。不同腺病毒的基因组大小有所差异，一般在26-45kb之间。按照腺病毒DNA复制的起始时间不同，其基因组可以划分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。早期转录基因包含有El(E1A和E1B)、E2(E2A和E2B)、E3和E4四个区，主要负责调节控制病毒的增殖复制。晚期转录基因包括Ll、L2、L3、L4和L5共五个区，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白。鸭腺病毒A型(DuckatadenovirusA，DAdV-A)属于腺病毒科(Adenoviridae)、富AT腺病毒属，也称为产蛋下降综合征病毒(Eggdropsyndromevirus，EDSV)，其基因组大小约为33.2kb。当鸭群免疫力降低时，感染EDSV，会出现呼吸道症状。鸭腺病毒B型(DuckaviadenovirusB，DAdV-B)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，基因组大小约为43.7kb。该病毒于1977年从法国爆发疾病的番鸭中分离得到，发病鸭临床表现为消瘦、跛行。鸭腺病毒C型(DuckaviadenovirusC，DAdV-C)是近年来新发现的鸭源腺病毒，属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，该病毒感染主要引起鸭出现肝脏肿大、出血及坏死，其基因组大小约为43.8kb。鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型都属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，而且两者之间全基因组的核苷酸同源性高达91％，常规分子生物学方法(如普通PCR)不容易区分，亟待一种鉴别鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高敏感、高特异性且能快速鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物和应用以及鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，所述引物的序列如下：上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法：利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，在制备区分鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型试剂盒上的应用。所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物的应用，在检测鸭腺病毒C型与鸭腺病毒B型感染情况方面的应用。较之现有技术而言，本专利技术的优点在于：1.本专利技术的PCR引物特异性强，能够对鸭腺病毒B型以及鸭腺病毒C型进行有效的扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出DNA片段。2.本专利技术根据鸭腺病毒B型和C型22K基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。可达到仅需一组引物，并结合两种鸭腺病毒22K基因核苷酸序列特征，利用SpeⅠ限制性内切酶进行酶切分析，即可特异性地对鸭腺病毒B型和C型进行鉴别诊断，当前国内外未见相关研究报道，本专利技术可填补相关领域空白。3.本专利技术的鉴定方法简单、经济、方便高效、准确率较高，可用于鉴别鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型。附图说明图1是鸭腺病毒B型和C型酶切位点的比较图。图2是本专利技术对鸭腺病毒B型和C型PCR扩增和酶切的电泳图。图3是目的片段测序结果分析图。图4是利用另一引物对鸭腺病毒B型和C型PCR扩增和酶切的电泳图。具体实施方式下面结合说明书附图和实施例对本
技术实现思路
进行详细说明：一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，所述引物的序列如下：上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。经分子生物学软件分析鸭腺病毒B型和C型22K基因的核苷酸序列发现，在342-347位这两种鸭腺病毒的酶切位点不同，鸭腺病毒B型的酶切位点为ACTAGT，能被SpeⅠ限制性内切酶所识别，而鸭腺病毒C型该位点的序列为CCTCGT(如图1所示)，不能被SpeⅠ限制性内切酶所识别。本专利技术就是根据鸭腺病毒B型和C型22K基因序列在342-347位的酶切位点不同，来设计特异性的引物和选取酶切位点。本专利技术的PCR引物对鸭腺病毒B型和C型均可扩增，扩增条带大小均为459bp。鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp，而鸭腺病毒C型扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后没有变化，还是原来PCR产物的片段。鸭腺病毒B型和C型混合扩增的PCR产物经限制性内切酶SpeⅠ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳可显示3条带，其中1条大小为459bp的条带是鸭腺病毒C型PCR扩增后未被SpeⅠ酶切开的产物，另外2条片段(1条大小为286bp，另1条大小为173bp)是鸭腺病毒B型扩增的PCR产物经SpeⅠ酶酶切后的产物。根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物有1条带(459bp)、2条带(286bp和173bp)还是3条带(459bp、286bp和173bp)即可特异性地对鸭腺病毒B型和C型进行鉴别诊断。为了对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行准确的区分，本专利技术的专利技术人设计了多组引物，但经实验发现该组引物(上游引物F以及下游引物R)的特异性最好，能够有效地对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA进行扩增，而对其他如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒等家禽常见病原并不能扩增出DNA片段；之后结合SpeⅠ限制性内切酶酶切分析，能够清楚、快速、便捷的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别。例如：本专利技术的专利技术人还设计了如下引物：F1:ATGACCCAAAAGCAAGTGGAR1:CCCTTGAGAATTTTRCACGC，以该组引物对制备的鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA，利用优化的条件进行PCR检测，反应结束后的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4中的1、2、3所示，图4中M为DL2000分子量标准；1为鸭腺病毒B型PCR扩增；2为鸭腺病毒C型PCR扩增；3为鸭腺本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，其特征在于：所述引物的序列如下：上游引物F：5’‑GCTAGACAGATCGAGGGAGG‑3’下游引物R：5’‑GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的PCR引物，其特征在于：所述引物的序列如下：上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’。2.一种鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以待检病毒样本的DNA为模板，进行PCR扩增，之后利用限制性内切酶SpeⅠ对PCR扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳观察酶切产物的片段数，特异性地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别诊断。3.根据权利要求2所述的鉴别鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的方法，其特征在于：它包括以下步骤：(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；(2)PCR扩增反应：利用上游引物F：5’-GCTAGACAGATCGAGGGAGG-3’和下游引物R：5’-GAAGAAGAGCAGAGTTGGCG-3’，以步骤(1)得到的DNA作为模板，进行PCR扩增反应；所述引物对鸭腺病毒B型的DNA以及鸭腺病毒C型的DNA均可扩增，扩增条带大小均为459bp；(3)PCR产物的酶切：将步骤(2)扩增的PCR产物进行SpeⅠ酶切反应；(4)琼脂糖凝胶电泳：对步骤(3)酶切所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳；观察琼脂糖凝胶电泳，鸭腺病毒B型的DNA扩增的PCR产物经SpeⅠ限制性内切酶酶切后，可切成2条片段，1条大小为286bp，另1条大小为173bp；鸭腺病毒C型的DNA扩增的PCR产物经...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翠腾，黄瑜，陈珍，朱春华，刘斌琼，蔡国漳，
申请(专利权)人：福建省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35