具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡制造技术

本发明专利技术属于动物免疫检测领域，具体涉及具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡。该试纸卡包括样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜和PVC胶板；胶体金采用双抗原夹心和双检测线；猪瘟病毒蛋白金标垫上包被有保藏号为CCTCC NO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG；所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏号为CCTCC NO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区。

【技术实现步骤摘要】
具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡
本专利技术属于动物免疫应用
具体涉及一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡。本专利技术的试纸卡可用于对猪瘟病毒抗体进行实时、快速的定量检测，对猪群健康水平、免疫后的抗体水平监测具有重要意义。
技术介绍
猪瘟(classicalSwinefever，CSF)是由猪瘟病毒(classicalSwinefevervirus，CSFV)引起的一种急性、热性、高接触性的猪传染病。猪瘟病毒主要通过消化道和呼吸道传染，其传播速度快，发病率和死亡率高，给全球养猪业带来巨大的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为16种A类法定通报的动物传染病之一。多年来猪瘟也危害我国养猪业的发展，是目前发生最多、危害最大、流行最广的传染病之一，我国农业部将其法定为一类传染病。猪瘟是一种急性烈性传染病，我国对猪瘟的成功控制主要依赖于疫苗免疫。因此，疫苗免疫效果的优劣对猪瘟的防控起到决定性作用。猪瘟抗体水平的检测是疫苗免疫效果评价的主要方法，同时猪瘟抗体水平检测对于猪瘟免疫疫苗程序的制订也具有重要意义。血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平，对疫苗免疫效果进行评价。常用的检测方法有猪瘟正向间接血凝实验、病毒中和试验、酶联免疫吸附试验等技术。其中间接血凝主观性强、检测效率低，不适合大批样品检测。酶联免疫吸附试验敏感性高、重复性好，但容易出现非特异性反应，且仅用于定性或者半定量检测。传统的猪瘟抗体定量测定方法是病毒中和试验，但此实验需要培养有感染能力的猪瘟病毒，没有资质的实验室难以开展此实验。且这些方法对操作人员、设备等有较高的要求，大多耗时较长(如血凝抑制试验需1～2小时；ELISA试验需2～3小时等)，不便于实时、快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassayGICA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。基于该技术，中国专利技术专利申请2008100004492公开一种快速检测猪瘟抗体的试纸条，该试纸条是通过肉眼判断检测线的有或无，来对猪瘟抗体进行阴性或阳性的定性检测，因而无法准确量化抗体含量；中国专利技术专利申请201610454481.2公开了一种快速定量检测猪瘟抗体的试纸盒及其制备方法，该试剂盒采用猪瘟E2和E0融合抗原分别作为标记抗原和捕获抗原，采用单检测线技术测定猪瘟病毒抗体含量，其样品浓度的定量检测线性范围具有一定的局限性。在常规的单检测线模式中，抗原抗体仅能够在有限区域反应，同时由于吸水垫和硝酸纤维素膜造成的样品液泳动迅速，导致抗原抗体反应时间短暂，使得检测线显色不明显，或对高含量检测物定量检测颜色差异度不显著。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有胶体金快速检测方法对定性检测或半定量以及定量检测方法中的灵敏度低和检测颜色差异度不显著的缺点，提供一种具有双抗原和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡与应用。本专利技术的试纸卡包括：样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜、PVC胶板。本专利技术的胶体金采用双抗原夹心和双检测线模式，其中所述的金标垫上包被有保藏编号为CCTCCNO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG，所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏编号为CCTCCNO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，二者构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区。当待检样品中含有猪瘟病毒抗体时，样本中的猪瘟病毒抗体泳动至金标垫位置与金标E2抗原发生反应，抗原抗体复合物层析到检测线位置时，包被在检测线上的E2a抗原与抗原抗体复合物中的抗体再次发生反应，从而在检测线位置形成“金标抗原-抗体-包被抗原”双抗原夹心复合物，并呈现肉眼可见的红色条带；同时金标垫中的金标兔IgG将与质控线区域的羊抗兔IgG反应，在质控线位置形成红色条带。当样本中抗体含量越高，硝酸纤维素膜上测试反应区检测线区域的红色条带颜色越深，反之则越浅。检测线显色的强度变化与待测抗体含量正相关，通过免疫定量速测仪对反应条带颜色密度值的自动识别和判读后分析出待测物的含量水平，从而实现定量检测。在本专利技术中，猪瘟病毒E2和E2a重组抗原的制备方法如下：用终浓度0.1mMIPTG分别诱导重组菌株大肠杆菌BL21/pE2(EscherichiacoliBL21/pE2)和大肠杆菌BL21/pE2a(EscherichiacoliBL21/pE2a)，表达产物经纯化后分别获得猪瘟病毒E2重组抗原和猪瘟病毒E2a重组抗原。重组菌株大肠杆菌BL21/pE2的制备方法：本专利技术在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取GenBank:FJ598611.1(ClassicalswinefevervirusstrainC-strain-ZJE2glycoproteingene)作为目标基因(核苷酸序列见SEQIDNO:1)。扩增E2蛋白基因，与pET-28a(+)载体连接，构建重组质粒pET-28a-E2(重组质粒pET-28a-E2的图谱见图1)。将上述重组质粒pET-28a-E2转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21感受态细胞，得到重组菌株大肠杆菌BL21/pET-28a-E2(EscherichiacoliBL21/pE2)，申请人将该重组大肠杆菌命名为大肠杆菌BL21/pE2，EscherichiacoliBL21/pE2，于2018年01月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2018060。重组菌株大肠杆菌BL21/pE2a的制备方法为：在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取GenBank:FJ598611.1(ClassicalswinefevervirusstrainC-strain-ZJE2glycoproteingene)部分基因序列作为E2a目标基因(核苷酸序列见SEQIDNO:2)。扩增E2a蛋白基因，与pET-28a(+)载体连接，构建得到重组质粒pET-28a-E2a。用重组质粒pET-28a-E2a转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到重组菌株大肠杆菌BL21/pET-28a-E2a(EscherichiacoliBL21/pET-28a-E2)，申请人将该菌株命名为大肠杆菌BL21/pE2a，EscherichiacoliBL21/pE2a，于2018年01月25日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2018059。申请人提供了一种具有双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡的制备方法，所述的方法包括：将样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜和PVC胶板；胶体金采用双抗原夹心和双检测线，其中：所述的猪瘟病毒蛋白金标垫上包被有保藏编号为CCTCC NO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG；所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏编号为CCTCC NO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，二者构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区；样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线和羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜、PVC胶板顺序依次组装。

【技术特征摘要】
1.一种具有双抗原夹心和双检测线的猪瘟病毒抗体定量检测试纸卡，其特征在于，所述试纸卡包括：样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线、羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜和PVC胶板；胶体金采用双抗原夹心和双检测线，其中：所述的猪瘟病毒蛋白金标垫上包被有保藏编号为CCTCCNO:M2018060的大肠杆菌BL21/pE2分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒金标E2抗原和金标兔IgG；所述的硝酸纤维素膜上包被有保藏编号为CCTCCNO:M2018059的大肠杆菌BL21/pE2a分泌的蛋白抗原构建的猪瘟病毒E2a抗原，二者构成一双检测线区和羊抗兔IgG构成的质控线区；样品垫、猪瘟病毒E2蛋白金标垫、兔IgG金标垫、吸水垫、包被猪瘟病毒E2a蛋白的双检测线和羊抗兔IgG的质控线的硝酸纤维素膜、PVC胶板顺序依次组装。2.猪瘟病毒E2和E2a重组抗原的制备方法，其特征在于：用终浓度为0.1mMIPTG分别诱导重组大肠杆菌BL21/pE2和重组大肠杆菌BL21/pE2a，表达产物经纯化后分别获得猪瘟病毒E2重组抗原和猪瘟病毒E2a重组抗原。3.一种重组的大肠杆菌BL21/pE2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取登陆号为GenBank:FJ598611.1的基因序列作为目标基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所述；扩增E2蛋白基因，将其与pET-28a(+)载体连接，构建得到重组质粒pET-28a-E2；用重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到保藏编号为CCTCCNO：M2018060的重组大肠杆菌BL21/pE2。4.一种重组的大肠杆菌BL21/pE2a的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在NCBI数据库中查找猪瘟病毒E2抗原蛋白基因组序列，选取登陆号为GenBank:FJ598611.1部分基因序列作为E2a目标基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所述；扩增E2a蛋白基因，将其与pET-28a(+)载体连接，构建得到重组质粒pET-28a-E2a；用重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，得到保藏编号为CCTCCNO：M2018059的重组大肠杆菌BL21/pE2a。5.权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锡玲，龙兴权，代娟，李佳，黄双龙，李筱雯，况世昌，吴贝，
申请(专利权)人：湖北华大瑞尔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42