一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测腐生葡萄球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，以及制备和使用这种试剂盒的方法。所述试剂盒中包括：(1)腐生葡萄球菌间接血凝抗原；(2)标准阳性血清；(3)标准阴性血清；(4)稀释液；并提供了试剂盒的制备和应用方法。本发明专利技术提供了一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其应用，该试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医有关单位以及养殖场广泛推广使用；本发明专利技术中的试剂盒在检测样品时只需简单的仪器耗材，全程在2‑3小时就能完成；结果判定直观，重复性好。能够快速，稳定，准确的检测腐生葡萄球菌的抗体。

【技术实现步骤摘要】
一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒及其制备方法，属于用于微生物的检测试剂

技术介绍
腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)属于凝固酶阴性葡萄球菌属，是一种广泛分布在自然界和人体体表的革兰氏阳性球菌，为条件性致病菌，在尿液,生殖道分沁物等感染标本中，都能检出腐生葡萄球菌，具有重要的临床意义。同时，腐生葡萄球菌也是是奶牛隐性乳房炎的主要病原菌，也是希腊香肠、盐水鸭和中国侗族传统发酵肉中常见的菌种。目前国内外对腐生葡萄球菌的研究报道甚少，对于腐生葡萄球菌的分子生物学检测技术主要依靠实验室细菌分离、PCR分子生物学鉴定，对于腐生葡萄球菌的血清抗体检测技术在国内外均未见报道。鉴于此，有必要开发一种可检测腐生葡萄球菌血清抗体的免疫学技术，可满足基层开展对腐生葡萄球菌快速有效的血清学诊断技术，减少对腐生葡萄球菌感染造成的误诊及漏诊，从而对腐生葡萄球菌在畜牧生产中的感染状况进行调查。
技术实现思路
本专利技术提供一种操作简单、方便、快速，成本较低，无需专业技术的检测腐生葡萄球菌血清抗体效价的间接血凝试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法，用来开展腐生葡萄球菌的流行病学调查。为了实现上述目的，本专利技术提供一种检测腐生葡萄球菌血清抗体的间接血凝试剂盒，所述试剂盒中包括：(1)腐生葡萄球菌间接血凝抗原1瓶(10ml)，4℃保存；(2)标准阳性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；(3)标准阴性血清1瓶(0.5ml)，-20℃冻存；(4)稀释液3瓶(10ml/瓶)，4℃保存。进一步的，上述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，可检测40～50份血清，保存期为6个月。进一步的，上述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述腐生葡萄球菌间接血凝抗原是将腐生葡萄球菌菌株CCTCCM2018117株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到的。进一步的，上述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述腐生葡萄球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml。混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存。(2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存。(3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀。将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清。用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍。(4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍。(5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液。将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min。然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度。(6)将腐生葡萄球菌MC2016的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原。(7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到腐生葡萄球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。进一步的，上述的腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的腐生葡萄球菌甘油菌MC2016，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO2箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10ml菌液转接到200ml胰蛋白胨大豆肉汤中，继续在37℃摇床中200r/min培养12～15小时，培养完毕后，将全部菌液以6000r/min离心15min，用磷酸盐缓冲液将菌体沉淀洗涤3遍，最后用10ml缓冲液悬浮菌体，吹散混匀，得到超声破碎用腐生葡萄球菌菌液；再将其置于碎冰中，在超声破碎仪中，以超声5s，间隔1s的程序，超声破碎30min，然后冻融1次，再超声破碎1次。将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，用紫外分光光度计测定上清中的蛋白浓度。将上述制备的腐生葡萄球菌抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈部皮下免疫5只体重2.5公斤左右的健康兔，接种抗原量200μg/只，2周后用同等剂量的抗原(与等体积弗氏不完全佐剂混合)加强免疫1次，间隔2周后再加强免疫1次。第3次免疫后2周，采血分离血清，用琼脂扩散试验检测血清抗体效价，效价达1:32及以上为合格阳性血清。若达不到标准，可继续加强免疫，直至血清效价符合标准。进一步的，上述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述标准阴性血清的制备方法为：选取体重2.5公斤左右、未感染腐生葡萄球菌的健康樱桃谷鸭，颈动脉放血直至死亡，将血液收集至大离心管中，旋紧盖子，室温过夜，然后3000r/min离心15min，收集血清，经琼脂扩散试验检测，结果为阴性，即为标准阴性血清。进一步的，上述的腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，所述稀释液的制备方法为：磷酸盐缓冲液中加入1％(v/v)的兔血清和0.01％(w/v)的叠氮钠，即为稀释液。具体制备量可根据实际需要调整。本专利技术的第二个目的是提供了上述一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒在检测腐生葡萄球菌血清抗体效价中的应用。进一步的，上述的应用，所述腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒的使用方法为：a)在96孔110°血凝板1～7排的1～12孔，第8排的1～8孔各加稀释液50μl。b)在血凝板1～6排的第1孔各加1份待检血清，每份血清50μl。用排枪从血凝板1～6排的第1孔开始依次往后作2倍倍比稀释，直至第8孔。在第7排的第1孔加50μl标准阳性血清，依次往后作2倍倍比稀释，至第12孔。在第8排的第1孔加50μl标准阴性血清，依次2倍倍比稀释至第4孔，第5～8孔为空白对照。c)每孔加入充分摇匀的腐生葡萄球菌间接血凝抗原25μl。d)血凝板置于微量振荡器上振荡1～3分钟，充分混匀，盖上玻璃板，室温或37℃静置1～2小时。e)根据细胞凝集程度判定待检血清效价，以出现50％红细胞凝集时的血清稀释倍数作为该份血清的抗体效价。本专利技术的优越性包括以下方面：a.试剂盒操作简单方便，适合在各基层兽医相关单位以及养殖场广泛推广使用。本专利技术中的试剂盒在检测样品时只需要96孔110°血凝板、移液器、移液器枪头和玻璃板等简单耗材以及温箱，不需要任何其它设备，即使在条件比较简陋的养殖场也可以使用。b.结果判定直观，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：腐生葡萄球菌间接血凝抗原，4℃保存；标准阳性血清，‑20℃冻存；标准阴性血清，‑20℃冻存；稀释液，4℃保存；所述腐生葡萄球菌间接血凝抗原是将腐生葡萄球菌菌株CCTCC M 2018117株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到。

【技术特征摘要】
1.一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：腐生葡萄球菌间接血凝抗原，4℃保存；标准阳性血清，-20℃冻存；标准阴性血清，-20℃冻存；稀释液，4℃保存；所述腐生葡萄球菌间接血凝抗原是将腐生葡萄球菌菌株CCTCCM2018117株进行增菌培养后，进行超声破碎，再离心取上清后，作为抗原致敏鞣酸处理过的绵羊红细胞得到。2.根据权利要求1所述的所述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，腐生葡萄球菌间接血凝抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)配制阿氏液：柠檬酸钠0.8克，柠檬酸0.055克，葡萄糖2.05克，氯化钠0.42克，双蒸水100ml；混匀后113℃高压10min，冷却至室温后4℃保存；(2)配制磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.2)：称取206.21克Na2HPO4·12H2O，30.46克KH2PO4，68克NaCl，加去离子水，定容至8000ml，混匀后121℃高压20min，冷却至室温保存；(3)静脉采集绵羊红细胞100ml，与100ml灭菌阿氏液混匀，在4℃静置5天，使红细胞充分沉淀；将沉淀好的红细胞摇匀，用灭菌纱布过滤，滤出液收集至大离心管中，以4000r/min离心15min，弃去上清；用磷酸盐缓冲液洗涤红细胞4遍；(4)用磷酸盐缓冲液将红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，与2.5％的戊二醛按照5:1(v/v)的比例慢慢混匀，置磁力搅拌器上搅拌4h，然后用磷酸盐缓冲液洗涤5遍；(5)用磷酸盐缓冲液将上述红细胞悬浮至5％(v/v)的浓度，再与等量1/20000(w/v)的鞣酸溶液混匀，即鞣酸溶液的终浓度为1/40000(w/v)，所用的溶液均为磷酸盐缓冲液；将上述红细胞悬液置于37℃水浴中，静置30min；然后用磷酸盐缓冲液洗涤4遍，最后用磷酸盐缓冲液重悬至5％(v/v)的浓度；(6)将腐生葡萄球菌MC2016的菌液于冰浴中超声破碎20min，然后冻融1次，再超声破碎1次，将破碎后的菌液6000r/min离心15min，取上清，即为用于致敏绵羊红细胞的抗原；(7)以步骤(6)得到的三种用于致敏绵羊红细胞的抗原致敏步骤(5)得到的绵羊红细胞悬液，得到腐生葡萄球菌间接血凝抗原，抗原致敏红细胞的终浓度为150μg/ml～200μg/ml。3.根据权利要求1所述的所述的一种腐生葡萄球菌间接血凝抗体检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性血清的制备方法为：取-80℃冻存的腐生葡萄球菌甘油菌MC2016，用接种环蘸取菌液，划线接种于胰蛋白胨大豆肉汤琼脂平板上，置于37℃、5％CO2箱中培养15～20小时，再挑取单克隆菌株接种于10ml胰蛋白胨大豆肉汤中，37℃，200r/min培养15～18小时，然后把10...

【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓炜，陈启伟，郑福英，刘永生，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62