一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法技术

本发明专利技术公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9‑15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6‑BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。本发明专利技术方法可有效防止甘蔗外植体褐化现象的产生，且不影响外植体的生长分化，是甘蔗健康种苗组织培养的一种有效方法。

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体地说，涉及一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。
技术介绍
甘蔗原产于热带、亚热带地区，是重要的糖料及能源作物，每年世界上总产量80％的蔗糖和40％的乙醇原料均来自于甘蔗。甘蔗系无性繁殖宿根栽培作物，易受甘蔗花叶病，宿根矮化病及黄叶病等的病原物反复侵害，使得品种退化，产量及含糖量下降。为了使优良品种的种性得以恢复，构建了甘蔗综合脱毒技术体系，用此技术体系所示的方法所生产的甘蔗脱毒健康种苗可以完全脱除以上病原菌并使甘蔗增产20-40％，蔗糖含量提高0.5-1.0％。此项技术体系中，甘蔗的组织培养是甘蔗脱毒健康种苗生产成功与否的关键因素之一，但是在甘蔗组织培养的过程中，外植体褐化现象普遍存在，严重影响外植体分化，严重的甚至导致外植体死亡。目前，甘蔗外植体防褐化技术研究的比较少，且多见于在培养基中添加抗氧化物质，从而降低外植体的褐化率。秦昌鲜等2011年在“防止甘蔗组织培养褐化初探”一文中提出，在培养基中添加生物素和硅酸钠，可推迟甘蔗外植体褐化出现时间，减轻褐化程度。吴转娣等2013年在“甘蔗胚性愈伤组织的诱导和抗褐化研究”中指出，在培养基中加入PVP或活性炭，能够有效减轻甘蔗组织的酚害，进而降低外植体褐化率。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对现有甘蔗组织培养过程中，外植体存在褐化现象的问题，提供了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9-15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6-BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。进一步地，所述外植体的采集步骤包括：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，经消毒及抗氧化处理后，在无菌水或1％的无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得到所述甘蔗外植体。进一步地，所述消毒方法为：先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后放入体积浓度为70-75％酒精中浸泡0.5-1min，之后放入加有2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液中处理10-15min，期间搅拌3-4次，最后用无菌水清洗3-4次。进一步地，采用抗氧化剂浸泡时间为15-30min。进一步地，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂中的一种。进一步地，所述MS+6-BA培养基为：将1mg/L6-BA加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min即得。进一步地，所述MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B60.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L。进一步地，所述6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。进一步地，所述培养的条件为：第1周为暗培养阶段：pH5.8-6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28-30℃，第2周为光培养阶段：pH5.8-6.0，光照强度100-120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28-30℃。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术采用MS+6-BA基础培养基，通过选择适宜的外植体，并对外植体进行预处理、常规消毒、抗氧化处理及培养条件优化后，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生，且对外植体的生长分化不会产生影响，是甘蔗脱毒健康种苗组织培养的一种有效方法。2)本专利技术外植体在无菌水或1％柠檬酸溶液中进行剥离，可有效减少外植体与空气中氧气的接触，并使水溶性多酚和醌类物质充分渗出外植体，从源头减轻外植体在培养过程中的褐化。3)本专利技术常规消毒过程中添加吐温-20，能有效增强消毒效果，避免因消毒不彻底而造成的外植体褐化及实验误差。4)实验验证，在甘蔗组织培养过程中，经聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠抗氧化剂处理后，不仅不影响甘蔗外植体的生长分化，而且还可有效防止甘蔗外植体褐化的产生，且甘蔗外植体褐化率可分别降低至12.2％、10.6％、12.4％。5)本专利技术对外植体采用先暗培养后光培养的方式培养，能减弱酚类物质的合成及氧化酶的活性，可有效控制外植体的褐化。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。本专利技术所述甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，包括如下步骤：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下的9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，放入培养箱中38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后，依次用70-75％酒精处理0.5-1min、含2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液处理10-15min，期间搅拌3-4次，后用无菌水清洗3-4次；然后放入抗氧化剂溶液中浸泡15-30min，取出晾干，在无菌水或1％无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得甘蔗外植体；将甘蔗外植体接种于MS+6-BA培养基中，在培养箱中进行培养，第1周为暗培养阶段，调节pH5.8-6.0，光照强度0μmol/(m2.s)，温度28-30℃；第2周为光培养阶段：pH5.8-6.0，光照强度100-120μmol/(m2.s)，光照时间12h/天，温度28-30℃。通过上述处理，可有效抑制甘蔗外植体褐化的产生。MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B10.05mg/L，维生素B60.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L；6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。6-BA配制好后，直接加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min，即得MS+6-BA培养基。抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂等具有抗氧化功能物质中的一种。本专利技术采用MS+6-BA基础培养基，通过选择适宜的外植体，并对外植体进行预处理、常规消毒、抗氧化处理及培养条件优化后，可有效抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9‑15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6‑BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9-15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6-BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。2.根据权利要求1所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述外植体的采集步骤包括：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，经消毒及抗氧化处理后，在无菌水或1％的无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得到所述甘蔗外植体。3.根据权利要求1或2所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述消毒方法为：先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后放入体积浓度为70-75％酒精中浸泡0.5-1min，之后放入加有2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液中处理10-15min，期间搅拌3-4次，最后用无菌水清洗3-4次。4.根据权利要求3所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，采用抗氧化剂浸泡时间为15-30min。5.根据权利要求3所述的甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，其特征在于，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂中的一种。6.根据权利要求1所述的甘...

【专利技术属性】
技术研发人员：武媛丽，杨本鹏，曹峥英，甘仪梅，张树珍，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46