一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法技术

本发明专利技术涉及一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，属于植物组织培养技术领域。该方法通过对新鲜彩纹秋海棠幼嫩叶片进行接种前冷藏保存处理，酒精和升汞消毒灭菌后，采用组织培养中不同光照培养方式结合不断转瓶处理，即先暗培养→半黑暗培养→光培养，并且每5~7d转接一次，从而有效防止甚至消除彩纹秋海棠褐化，降低了褐化率并在一定程度上提高其诱导率，促进植物的生长。本发明专利技术方法与已有的降低褐变的方法相比，无需增加专用设备，使用浓度小，成本低，操作简便，易于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法
本专利技术属于植物组织培养
，具体涉及一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法。
技术介绍
彩纹秋海棠（Begoniamasoniana）为秋海棠科秋海棠属多年生常绿草本植物，叶卵形，表面有皱纹和刺毛，黄绿色叶面中央嵌有红褐色的马蹄形环带，十分秀丽，是秋海棠中较为名贵的品种。然而，作为秋海棠属植物的一种，其种子不易获得，有性繁殖能力弱，且后代多变异，优良性状难以保持。植物组织培养技术作为当代新兴的生物技术方法之一，具有繁殖系数高、遗传性状稳定、不受季节限制等诸多优点，因而十分适用于优秀观赏植物的推广繁殖，目前已广泛应用于马蹄莲、兰花、菊花、月季等观赏植物的再生产，秋海棠属植物中也有许多品种组培成功。但关于彩纹海棠组织培养的报道较少，而且常规的组织培养存在着严重的褐化问题，严重限制了彩纹秋海棠的组织培养效率。因此，褐化能否得到有效控制是彩纹秋海棠组织培养成功与否的关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，通过该种方法可以对彩纹秋海棠组织培养过程中出现的褐化问题进行改善，提高存活率，从而顺利诱导出丛生芽。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1~2d；步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为70%~75%的酒精浸泡20~30s，再用质量浓度为0.1%~0.15%HgCl2溶液处理5~8min，接着用无菌水漂洗多次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成叶盘；步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5~7d更换一次新的初代培养基，持续转接3~5次；步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每20~30d继代一次，即可获得不定芽；初代培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂和2.0g/L活性炭，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；不定芽诱导培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、2.0g/L活性炭、80mg/LVC，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。进一步，优选的是，步骤（2）中，所述的无菌水漂洗多次为3~5次。进一步，优选的是，步骤（2）中，每次漂洗2min。进一步，优选的是，步骤（2）中，叶盘大小为1.8~2.2cm2。进一步，优选的是，步骤（4）中，每侧缝隙的宽度为4.8~5.2cm。进一步，优选的是，步骤（4）中，所述的纸箱为牛皮纸箱。本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：通过对新鲜彩纹秋海棠幼嫩叶片进行接种前冷藏保存处理，保证了彩纹秋海棠叶片的诱导率且降低其污染率及褐化率；通过酒精和升汞消毒灭菌，降低了初代培养的污染率及褐化率并保证其诱导率；采用组织培养中不同光照培养方式结合不断转瓶处理（即先暗培养→半黑暗培养→光培养，并且每5~7d转接一次），能够降低80%~90%的褐化率，从而有效防止甚至消除彩纹秋海棠褐化，并在一定程度上提高其诱导率，促进植物的生长。本专利技术方法与已有的降低褐变的物质相比，无需增加专用设备，使用浓度小，成本低，操作简便。附图说明图1为通过本专利技术方法获得的彩纹秋海棠不定芽图；图2为通过本专利技术不定芽诱导获得的彩纹秋海棠完整植株图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细描述。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限定本专利技术的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。实施例1一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1d；步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%HgCl2溶液处理5min，接着用无菌水漂洗3次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm2大小的叶盘；步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5d更换一次新的初代培养基，持续转接3次；步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去牛皮纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每20d继代一次，即可获得不定芽；初代培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂和2.0g/L活性炭，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；不定芽诱导培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、2.0g/L活性炭、80mg/LVC，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。实施例2：一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，包括如下步骤：步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存2d；步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为75%的酒精浸泡30s，再用质量浓度为0.1%HgCl2溶液处理8min，接着用无菌水漂洗3次，每次漂洗2min；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成2cm2大小的叶盘；步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入牛皮纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射，每侧缝隙的宽度为5cm；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1~2d；步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为70%~75%的酒精浸泡20~30s，再用质量浓度为0.1%~0.15%HgCl2溶液处理5~8min，接着用无菌水漂洗多次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成叶盘；步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5~7d更换一次新的初代培养基，持续转接3~5次；步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx，光照时间为10~12h/d；每20~30d继代一次，即可获得不定芽；初代培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L 6‑BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂和2.0g/L活性炭，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用；不定芽诱导培养基为MS培养基，培养基中添加0.5mg/L 6‑BA、0.1mg/L NAA、30g/L蔗糖、6.5g/L琼脂、2.0g/L活性炭、80mg/L VC，pH5.8，高温灭菌冷却至室温后待用。...

【技术特征摘要】
1.一种降低彩纹秋海棠叶片组织培养褐化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），冷藏保存处理：将新鲜的彩纹秋海棠幼嫩叶片在4℃冰箱冷藏保存1~2d；步骤（2），外植体消毒与处理：将步骤（1）处理的幼嫩叶片用洗衣粉水洗净后，先用体积浓度为70%~75%的酒精浸泡20~30s，再用质量浓度为0.1%~0.15%HgCl2溶液处理5~8min，接着用无菌水漂洗多次；然后在无菌条件下用无菌滤纸吸去水分，之后把叶片切成叶盘；步骤（3），暗培养：将步骤（2）得到的叶盘背面划伤口，叶片背面朝下接种初代培养基中，置于黑暗条件下培养5d，培养温度23±2℃；步骤（4），半黑暗培养：将步骤（3）的培养物转接至新的初代培养基中，然后放入纸箱中，盖紧纸箱，在纸箱两侧各切开一条透光缝隙，保证有散射光进入纸箱内，但要避免光直射；将纸箱置于光照培养室内，培养温度23±2℃，光照时间10~12h/d，光照强度2000~3000lx；每5~7d更换一次新的初代培养基，持续转接3~5次；步骤（5），光培养：将步骤（4）的培养物接种至不定芽诱导培养基中，撤去纸箱，直接放置于培养架上进行光照培养，培养温度为23±2℃，光照强度为2000~3000lx...

【专利技术属性】
技术研发人员：段青，王继华，杜文文，马璐琳，王祥宁，崔光芬，贾文杰，
申请(专利权)人：云南省农业科学院花卉研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53